金针菇乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选条件的优化与应用

余淑英 卢 艳 王星丽 瞿 亮 孙培龙 张安强*



金针菇乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选条件的优化与应用

余淑英1卢 艳1王星丽2瞿 亮2孙培龙1张安强1*

（1. 浙江工业大学食品科学技术系，浙江杭州 310014；2. 杭州百山祖生物科技有限公司，浙江杭州 310052)

经优化乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选条件，结合体外乙酰胆碱酯酶的活性，筛选出具有抗阿尔茨海默的高抑制活性的均一金针菇子实体多糖组分；采用改良的Ellman法，建立乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选系统，考察其最大吸收波长、AChE的浓度、ATCI的浓度、显色剂DTNB的浓度，以及反应体系的时间对系统的影响，最终确定反应体系的最佳条件为：酶反应体系的反应温度37 ℃，反应时间30 min，最佳检测波长412 nm，AChE的浓度0.05 u/mL，ATCI的浓度0.10 mmol/L，pH=8.0的100 mmol/L PBS缓冲溶液，显色剂DTNB终浓度0.066 7 mmol/L，通过乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选发现了金针菇多糖抑制剂。

金针菇多糖；乙酰胆碱酯酶抑制剂；筛选条件优化

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）即老年痴呆症，是以记忆损伤、认知功能障碍、行为障碍和自理能力下降为特征的慢性神经退行性疾病[1,2]。研究认为，阿尔茨海默病是一种多病因的疾病，胆碱假说是较能够接受的病理理论，乙酰胆碱酯酶抑制剂是治疗该类疾病的有效药物[3,4]。研究表明，乙酰胆碱酯酶抑制剂不仅能够提高脑内乙酰胆碱的含量，而且能够阻止Aβ淀粉斑的形成[1~5]。这对于阿尔茨海默（AD）和很多神经系统疾病的发病病理的研究和初期治疗具有非常重要的作用。乙酰胆碱酯酶抑制剂是目前美国FDA唯一允许用作治疗老年痴呆症的药物，其中有4种药物获得许可，分别为塔克林（Tacrine），加兰他敏（Galantamine）、多奈哌齐（Donepezil）、利斯的明（Rivastigmine）[6,7]，多属于生物碱类。老年痴呆症具有发病缓慢、持久的特点，需要长期服药才能见效，而上述几种药物多半衰期短，易引起患者肝、胃器官不适等副作用，严重阻碍了其应用。而从天然产物中开发的适宜患者长期服用、毒副作用小、作用面广的乙酰胆碱酯酶抑制剂则成了一个研究的热点[2]。

金针菇被誉为“增智菇”，富含蛋白质、多糖、脂类等，其多糖粗提物能改善记忆障碍模型小鼠的学习记忆能力。范青生等的研究表明，金针菇菌丝体悬液具有显著增强小鼠学习能力，巩固和强化小鼠记忆的作用；并能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，增加T细胞的数目，促进溶血素抗体的生成[8]。袁仲研究发现金针菇子实体可显著改善记忆力障碍小鼠的学习记忆能力，且可活化淋巴细胞而产生免疫反应[9]。邹宇晓等研究发现，金针菇多糖粗提物可有效改善模型小鼠、大鼠的学习记忆能力，从动物行为学指标上证明了多糖的改善记忆功能[10]。杨文建等通过研究金针菇不同提取物（水相、石油醚相、乙酸乙酯相和乙醇）的体外乙酰胆碱酯酶活性，发现水提物具有较强的乙酰胆碱酯酶的抑制活性[11]。为了探索金针菇改善记忆力的作用机制，本课题对乙酰胆碱酯酶抑制活性的筛选条件进行优化，得到了金针菇多糖抑制乙酰胆碱酯酶活性的最佳条件，为新型乙酰胆碱酯酶抑制剂的设计合成提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金针菇子实体由杭州百山祖生物科技有限公司提供，粉碎成细粉状备用。试剂有碘代硫代乙酰胆碱（Acetyhhiocholine, ATCI，美国sigma公司）、乙酰胆碱酯酶（Acetyl cholinesterase, AChE，美国sigma 公司）、二硫二硝基苯甲酸（5,5`-Dithio bis-2- nitrobenzoic acid，DTNB，美国sigma公司）、十二烷基磺酸钠（SDS，分析纯，纯度＞99.0%，美国sigma 公司）、阳性对照石杉碱甲（Huperzine A，纯度＞99.0%），均购自阿拉丁试剂公司，其他均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机（日本Hitachi（日立）公司），数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂），SENCO旋转蒸发器（上海申生科技有限公司），Spectra Max M5微孔板检测系统（美国Molecular Devices公司），96孔酶标板（美国康宁公司），DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司），ALPHA 2-4 LD冷冻干燥机（德国Christ公司），Waters1525 高效液相仪（美国Waters公司），Waters2414 示差检测器（美国Waters公司），TSKgel G4000PWXL 高效液相色谱柱（日本TOSOH公司）。

1.3 方法

（1）金针菇多糖的制备。称取烘干至恒重的金针菇子实体1 600 g进行粉碎，95%乙醇回流（脱去部分脂类、色素以及其他一些小分子物质），超声辅助水提醇沉法[5] 提取，离心，得到的上清液分别用40%、60%、80%乙醇沉纯，再离心得上清液40%、60%、80%组分。采用savage法，即用氯仿︰正丁醇（4︰1）溶液反复萃取3～4次，离心除去有机试剂层，浓缩挥干残余有机试剂，除去粗多糖中游离的蛋白，各组分溶液冷冻干燥得到黄色固体粉末，分别命名为FVP40、FVP60和FVP80。

（2）乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选优化条件。

AChE在100 mmol/L、37 ℃、pH=8.0的PBS中保持良好的活性[12]，选用该条件下的PBS及反应温度。根据Ellman法[13]，反应体系检测波长选择412 nm。配置1 U/mL的AChE稀释液400 μL，分别吸取上述AChE稀释液10、20、40、60、80、100 μL于6个编号的洁净干燥离心管中，用PBS（c=100 mmol/L，pH=8.0）缓冲溶液补充体积到100 μL，得到不同浓度的AChE标准溶液。取10 μL上述不同浓度的AChE溶液，70 μL pH=8.0的PBS，20 μL 1 mmol/L的DTNB溶液于96孔酶标板中，37 ℃、预孵2 min，加入20 μL1 mmol/L的底物ATCI溶液，37 ℃恒温反应，每隔90 s测定412 nm处吸光度值（OD），PBS（c=100 mmol/L，pH=8.0）缓冲溶液为空白对照，60 min，重复3次，确定酶反应终浓度[14]。

图1 总糖的标准曲线

注：为双倒数图，纵轴上的截距为1/Vm，横轴上的截距为-1/Vm，直线的斜率为Km/Vm。

底物ATCI终浓度的确定[15]：PBS（c=100 mmol/L，pH=8.0）缓冲溶液为空白对照，对0.1、0.13、0.2、0.3、0.6、0.8、1.2 mmol/L的ATCI溶液反应初速度进行测定，测试条件同上，每隔60 s测定412 nm处吸光度值，共45 min，平行测3次，以确定最终ATCI浓度。

显色剂DTNB终浓度的确定[16]：配置1.0 mmol/L DTNB储备液。PBS缓冲溶液为空白对照，分别对0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L不同浓度的DTNB溶液的反应初速度进行测定，测试条件同酶反应终浓度。3次平行试验。

反应时间的确定[17]：体系反应时间确定的测试条件同酶反应终浓度，每隔60 s测定一次412 nm处OD值。PBS缓冲溶液代替AChE溶液为空白对照。测定3次，3次平行试验。

样品抑制率：将样品配成各种浓度待测。吸取10 μL 不同浓度的样品溶液，70 μL pH=8.0的PBS，20 μL DTNB溶液于96孔酶标板中，37 ℃、预孵2 min，后加20 μL ATCI溶液，37 ℃恒温反应30 min再加入20 μL SDS终止反应，酶标仪412 nm处测定吸光度值。完全抑制组用10 μL石杉碱甲溶液代替10 μL样品溶液；空白组用10 μL PBS（pH=8.0）代替10 μL样品溶液，样品对照组用15 μL LPBS（pH=8.0）代替15 mL AChE溶液。

2 结果与分析

2.1 粗多糖的分离

（1）总糖的标准曲线。根据苯酚－硫酸法所测定的结果画出散点图的总糖标准曲线（图1），散点拟合的直线方程为=0.008 5+0.024 9，2=0.995 5。其中为葡萄糖含量（μg），为490 nm处的吸光值。

（2）还原糖的标准曲线。DNS比色法测得还原糖标准曲线（图2），散点拟合直线方程为=0.008 5+0.024 9，2=0.997 7。其中为葡萄糖含量（μg），为520 nm处的吸光值。

（3）FVP40、FVP60、FVP80组分的多糖。 采用水提醇沉法得到的各组分，根据还原糖的标准曲线方程和总糖的标准曲线方程，可求得FVP40、FVP60、FVP80粗多糖的还原糖和总糖的含量。HPLC测得各组分的液相数据，可根据标准曲线计算得到分子量范围（表1）。

表1 三组分的粗多糖产量、糖含量及分子量

2.2 乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选优化条件

（1）酶反应终浓度[18]。以不同酶浓度下的反应初速度0为纵坐标，酶浓度为横坐标作线性回归图（图3），得到线性回归方程：=0.207 5+0.000 4，相关系数=0.994 2。结果表明，直接反应酶浓度与吸光值成正比例关系，乙酰胆碱酯酶在0～0.066 7 U/mL范围内保持良好的线性关系，故反应体系酶终浓度应控制在0.066 7 U/mL以内。由于实验室条件限制，查阅相关文献，乙酰胆碱酯酶的终浓度确定为0.05 U/mL。

图3 乙酰胆碱酯酶浓度与反应初速度的关系

图4 乙酰胆碱酯酶活性的Lineweaver-Burk曲线

图5 显色剂DTNB终浓度与吸光值的关系

图6 乙酰胆碱酯酶反应过程曲线图

（2）底物ATCI终浓度[19]。按Lineweaver-Burk法作双倒数图（图4）[20]，可得米氏常数Km的值为0.095 mmol/L。由于在筛选酶抑制剂时，并不知道抑制剂的作用类型，为减少IC50的误差，使筛选体系灵敏度更高，所用底物的浓度应接近Km值，因此该反应体系的底物ATCI终浓度确定为0.10 mmol/L。

（3）显色剂DTNB终浓度。在酶浓度0.05 U/mL和底物浓度0.10 mmol/L条件下，吸光度值随着衍生剂DTNB的浓度增大而增大（图5）。当显色剂DTNB浓度达到0.007 mmol/L时吸光值不再增大，说明反应已达饱和，结合实际操作，显色剂DTNB的终浓度确定为0.066 7 mmol/L。

（4）反应时间[21]。AChE催化水解ATCI需要一定的时间，若反应时间过短，吸光度值太小，背景干扰比较大；反应时间过长，AChE活性则会出现衰减，不能准确测定酶的活性。结果如图6所示，在30 min之内乙酰胆碱酯酶的反应呈良好的线性关系，反应处在稳态阶段[22]。为了在较短的时间内得到较为准确的实验数据，选取30 min作为反应时间，此时的OD412可间接反映其反应速率。

2.3 乙酰胆碱酯酶抑制活性的筛选条件

反应体系的总体积120 μL，缓冲体系pH=8.0的100 mmol/L PBS缓冲溶液，AChE终浓度为0.05 U/mL，ATCI终浓度为0.10 mmol/L，显色剂DTNB终浓度为0.066 7 mmol/L，体系反应温度37 ℃，反应时间30 min，测定波长为412 nm。此外，当石杉碱甲的浓度为70 μg/L[2]时，已达到了酶筛选模型的标准，所以阳性对照为70 μg/L的石杉碱甲。

2.4 FVP40、FVP60、FVP80三组分乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究

分别配制三组分0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的样品溶液。采用2.3节的酶活测试条件，酶标仪中反应30 min后测412 nm处的吸光值。结果如图7所示，FVP60组分浓度为0.8 mg/mL时对乙酰胆碱酯酶活性的抑制率最高，达到46.17%，此时FVP80组分的乙酰胆碱酯酶活性抑制率最低。总的来看，三组分对乙酰胆碱酯酶的抑制能力为FVP80＜FVP40＜FVP60，并随样品浓度的增加呈现出先增强后减弱的趋势，FVP60表现出较好的乙酰胆碱酯酶的抑制活性。

3 讨 论

采用改良的Ellman法建立了金针菇乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选优化条件：100 mmol/L、pH=8.0 PBS缓冲溶液，AChE、ATCI、显色剂DTNB的终浓度分别为0.05 u/mL、0.10 mmol/L、0.066 7 mmol/L，阳性对照石杉碱甲70 μg/L，体系反应温度37 ℃，反应时间30 min，测定波长412 nm。该法准确可靠，灵敏度高，重现性好，能够达到对抑制物的快速筛选。且在此条件下测定从金针菇子实体中提取的三个组分均对乙酰胆碱酯酶表现显著的抑制活性，其中FVP60组分在0.8 mg/mL浓度下对乙酰胆碱酯酶活性的抑制率最高，达46.17%。以上结果表明，金针菇多糖对乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究具有巨大的潜力，为金针菇多糖的进一步开发和利用提供了一定的科学依据，同时也为老年痴呆症的治疗药物研制提供一种新的思路。

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Optimization and application of acetylcholinesterase inhibitor screening criteria from the fruiting body of

Yu Shuying Lu Yan Wang Xingli Qu Liang Sun Peilong Zhang Anqiang

（1. Department of Food Science and Technology, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China）（2. Hangzhou Baishanzu Biological Science and Technology Co. Ltd, Hangzhou 310052, China）

In order to optimize the screening conditions for acetylcholinesterase inhibitors and combine with in vitro activity of acetylcholinesterase and screen with high inhibiting activity of anti-Alzheimer uniformpolysaccharide. The improved Ellman method was used to establish an acetylcholinesterase inhibitor screening system and investigate influences on the system by the maximum absorption wavelength, the concentration of AChE, ATCI concentration, the concentration of reagent DTNB, time of system, and ultimately determine the optimum conditions of the reaction system. A screening model for AChEIs was optimized with temperature 37 ℃, reaction time 30 min, wavelength 412 nm, the concentration of AChE 0.05 u/mL, a concentration of ATCI 0.10 mmol/L, 100 mmol/L PBS buffer solution pH=8.0, color agent DTNB final concentration 0.066 7 mmol/L; Through the screening of acetylcholinesterase inhibitors found FVP inhibitors.

polysaccharide of; acetylcholinesterase inhibitor; screening and optimization

S646

A

2095-0934（2017）01-034-06

国家十二五科技支撑项目“食用菌深加工产品开发与产业化”（2013BAD16B07）

，E-mail：zhanganqiang@zjut.edu.cn