DNA的滚环扩增合成研究

刘淑贞 张志庆 王 芳 周 亭 王秀凤 张国栋 刘婷婷 张洪芝

(中国石油大学(华东)理学院，山东 青岛 266580)

DNA的滚环扩增合成研究

刘淑贞 张志庆＊王 芳 周 亭 王秀凤 张国栋 刘婷婷 张洪芝

(中国石油大学(华东)理学院，山东 青岛 266580)

滚环扩增(RCA)反应作为一种简单高效的等温酶促反应，现已发展为核酸扩增领域的新技术，其产物在组装体搭建和多功能材料的制备方面有着广泛的应用。本文采用琼脂糖凝胶、紫外和透射电镜(TEM)等手段，探究了时间、三磷酸脱氧核糖核苷(dNTPs)、酶以及引物的浓度等因素对脱氧核糖核酸(DNA)滚环扩增产物的影响。结果表明：在反应开始的前30 min，RCA产物的长度受时间的影响比较明显；随着dNTPs浓度的提高，RCA产物的链长增长，浓度也不断提高；酶和引物的浓度对滚环扩增产物的长度没有明显影响，但对RCA产物浓度的影响较大，过量的酶致使RCA产物的含量显著下降。

滚环扩增技术；核酸；dNTPs；聚合酶；引物

1 引 言

近年来，分子生物学和生物化学发展迅速，新的核酸扩增技术不断涌现，滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)反应作为一种简单高效的等温酶促反应发展迅速，现已成为核酸扩增技术的新宠1。在RCA反应中，聚合酶连续不断地将核苷酸添加到环状模板的引物上，形成一条含有几十、几百甚至上千个相互串联重复单元的单链 DNA。不同于聚合酶链式(Polymerase Chain Reaction，PCR)反应需要昂贵精密的设备和热稳定性的聚合酶2，RCA反应可以在恒温条件下的溶液中，固相支持物上，甚至一个复杂的生物环境中进行反应3。

滚环扩增反应作为一种强大的核酸扩增工具，其产物在许多方面都有着广泛的应用。如Mao等4利用长度不同的RCA产物与金纳米颗粒进行组装，得到不同长度的金纳米线；Willner等5将RCA产物作为酶有序装配杂交复合材料的骨架，表现出强大的结构衍生性功能；在DNA折纸术6中，利用长度合适的RCA产物作为骨架链，添加互补短链作为脚手架链，制备具有不同形貌的组装体7,8。基于RCA产物搭建的组装体含有众多的重复单元，这种独特的组装体可携带大量的用于检测和治疗的物质，例如荧光素、生物素、抗体、纳米粒等；同时也可以通过环状模板的设计，将RCA产物设计成含有适配子、DNA酶、垫片、内切位点等功能化序列，制备多功能材料用于生物识别、药物递送、生物传感等9−20。现在，滚环扩增技术又在DNA纳米粒子(DeNAno)：新型多价亲和试剂21方面崭露头角，这更加拓宽了滚环扩增技术的应用。

控制RCA产物的长度和浓度对于后续的组装和应用至关重要，但是鲜见较系统的研究各种合成条件对RCA产物影响的报道。因此，本文系统考察了时间、dNTPs的浓度、酶的浓度以及引物的浓度等因素对RCA产物长度和浓度的影响，并利用琼脂糖凝胶电泳、紫外和TEM等手段对RCA产物进行表征。

表1 核苷酸序列Table 1 Sequences of oligonucleotides used in RCA reactions.

2 实验部分

2.1 试 剂

实验所用核苷酸序列(序列见表 1)及dNTPs(dATP，dTTP，dGTP，dCTP)均购自大连

Takara 生物技术公司(序列见表 1)，保存在−20 °C；phi29 DNA 聚合酶，购买于 Thermo Fisher Scientific，保存于−20 °C；琼脂糖、TAE缓冲溶液、6 × 上样缓冲液和DNA标准条带(DNA Ladder，0.2−10 kb, 21 bands)均购买于碧云天生物技术。本文中用水皆为高纯水。

2.2 合成及表征方法2.2.1 滚环扩增合成

取一定量的环状DNA1模板于离心管中，加入一定量的引物DNA2和dNTPs，用混匀仪混匀15 s；再加入一定量的phi29 DNA聚合酶及缓冲溶液和一定量的水，混匀，在30 °C下反应一段时间，65 °C下终止反应。

2.2.2 琼脂糖凝胶电泳表征

配置1 × TAE缓冲溶液，至于水平电泳槽中，用于跑胶。取 2 μL DNA ladder加入 2 μL 6 × 上样缓冲液和6 μL H2O混匀，再各取8 μL RCA产物和2 μL 6 × 上样缓冲液混匀，在0.6%琼脂糖凝胶上进行上样，300 V恒压下进行电泳，在凝胶成像仪下进行观察和拍摄。本文琼脂糖凝胶电泳所用ladder皆与图1a中一致。

2.2.3 吸收光谱表征

首先对微量紫外分光光度计(Nanodrop，杭州奥胜 Nano-100)进行空白校准，然后取2 μL RCA产物置于Nanodrop上进行测试，保存数据和图片，进行数据分析。

图1 时间对RCA产物的影响Fig.1 Effect of reaction time on RCA product.(a, b) the agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different time. bp indicates the number of bases.

2.2.4 透射电镜表征

取10 μL RCA产物置于铜网上沉积一段时间，1%醋酸双氧铀染色，使用日本电子 JEM-2100高分辨透射电镜进行表征和分析。

3 结果与讨论

3.1 时间的影响

首先考察不同反应时间对 RCA产物的影响，从图1a和1b上可明显的发现，反应开始的前半个小时，RCA产物的长度受时间的影响比较显著，之后随时间的延长RCA产物的长度不再有明显改变。早期的RCA研究者，Eric T Kool等发现时间对RCA产物的长度有着一定的影响22，而我们的实验结果与之非常类似。胶谱图1a上RCA产物的亮度随着反应时间的延长而逐渐变亮，说明最开始反应阶段不仅产物的长度比较短，而且浓度也比较低。反应过程中，随着时间的延长产物的长度不断增长，浓度也逐渐增加，直至反应达到平衡22。在反应的过程中，长时间反应的体系中有白色絮状沉淀物析出，因为在反应初期，RCA产物首先形成一种无定形结构，随着反应的进行，RCA产物在基质表面形成一些类晶结构，RCA产物继续在这些类晶结构的表面上进行组装形成花瓣结构，逐渐形成花状球形结构。RCA产物可以通过链内和链间的杂交(DNA纳米花的组装不依赖于传统的Watson-Crick碱基配对)进行交联形成紧密的结构，在局部累积形成DNA纳米花23。用TEM对30 min的反应产物进行扫描，观察到有很多粘连的球状物，尺寸在300 nm左右(如图2a和2b)。

3.2 dNTPs的影响

在RCA体系中加入不同浓度的dNTPs，发现dNTPs的浓度对RCA产物的长度有着非常显著的影响。从胶谱图3a上可以明显观察到，随着dNTPs浓度的增加，RCA产物的长度不断增长；当dNTPs的浓度增加到一定值时(环状DNA1模板：dNTPs摩尔浓度比为1 : 250)，RCA产物的长度则不再明显增长，再增加dNTPs的浓度对RCA产物长度的影响已经不大，这可能是由phi29 DNA聚合酶的聚合扩增能力决定的24。

如图3c所示，RCA产物的浓度随dNTPs浓度的提高而不断提高，而且随着dNTPs浓度的提高，体系紫外吸收峰的位置逐渐左移靠近 260 nm(图3b)。OD260与OD280吸光度的比值越接近1.8(OD为光密度)，代表DNA的纯度越高，超过或低于 1.8都代表有别的污染物；而 OD260与OD230吸光度的比值一般在 1.8−2.2之间，表明DNA纯度较好25−27。图 3d所示，Nanodrop分析给出的 OD260/280的比值逐渐接近 1.8，OD 260/230的吸光度比值逐渐接近 2.0，说明随着dNTPs浓度的增加，体系中RCA产物的含量逐渐提高，至环状DNA1模板与dNTPs的摩尔浓度比为1 : 500时，体系中RCA产物的含量达到最高。在dNTPs浓度较低时，RCA反应启动的数量受限，随着dNTPs浓度的提高，RCA反应启动的数量增加，体系中RCA产物的含量不断增加，直至体系中环、引物和酶被充分利用。

3.3 酶的影响

聚合酶在整个RCA反应中有着非常重要的作用，只有在聚合酶的作用下，才能启动整个反应。而在 RCA反应体系中，使用聚合酶的种类不同，对反应产物的影响也不尽相同28。随着滚环扩增技术的发展，新型的聚合酶不断地被发现使用。本文选用的phi29 DNA聚合酶，具有强大的链取代能力和高效的持续扩增能力，可以克服拓扑约束并有效地形成单链DNA29。

图2 RCA产物的TEM图Fig.2 TEM images of the RCA product.(a, b) TEM images of the RCA product at 30 min.

图3 dNTPs摩尔浓度对RCA产物的影响Fig.3 Effect of dNTPs molar concentration on RCA product.(a) The agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different concentrations of dNTPs; (b) The UV-Vis spectra of RCA product at different concentrations of dNTPs; (c) The concentration of RCA product at different concentrations of dNTPs; (d) Comparison of analytical data for OD260/280 and OD260/230 at different concentrations of dNTPs. OD ratio represents the absorbance ratio.

图4 phi29 DNA聚合酶对RCA产物的影响Fig.4 Effect of phi29 DNA polymerase on RCA product.(a) The agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different concentrations of phi29 DNA polymerase;(b) The UV-Vis spectra of RCA product at different concentrations of phi29 DNA polymerase;(c) Comparison of analytical data for OD260/280 and 260/230 at different concentrations of phi29 DNA polymerase.U indicates enzyme activity concentration.

实验中加入不同浓度的phi29 DNA聚合酶进行反应，考察酶的活性浓度对RCA产物长度和浓度的影响。结果发现phi29 DNA聚合酶对RCA产物的长度并没明显的影响(图4a)，但对RCA产物的浓度影响显著(图4b)，随着酶浓度的提高，RCA产物的浓度先增大后减小。同时，Nanodrop分析给出的OD260/280和OD260/230吸光度比值显示(图 4c)，随着酶浓度的提高，体系中 OD260/280的比值先接近1.8随后降低，OD260/230的比值先接近2.0随后降低，说明随着酶浓度的增加，过量的酶影响了RCA产物的相对含量。酶浓度的增加(体系中蛋白含量逐渐增加)，在环、引物和dNTPs的起始量相同的条件下，酶的加入量越多，在反应最终结束时，RCA产物的相对含量越低。而这对后续RCA产物的提纯不利，因此在RCA反应顺利进行的前提下可以降低酶的浓度，这样既可保证体系的产率，又降低了经济成本。

3.4 引物的影响

为了考察引物对RCA产物的影响，设计相同反应时间下引物浓度不同的实验。胶谱图5a所示，RCA产物的长度不随引物浓度的改变而改变，产物的浓度随引物浓度的提高而增加。由于引物的浓度决定了酶的附着位点，也决定了RCA反应引发的数量，继而决定了RCA产物的浓度。图5b所示，当环状DNA1模板与引物摩尔浓度比为1 : 1时，RCA产物的浓度达到最高，再增加引物浓度RCA产物的浓度反而有所下降。Nanodrop分析给出的OD260/280和OD260/230吸光度的比值随引物的增加而逐渐增大(图 5c)，至环状 DNA1模板与引物摩尔浓度比为1 : 1时，OD260/280的比值达到1.8左右，再增加引物反而影响了RCA产物的含量。因为随着引物的增加，酶的附着位点增多，引发的RCA反应增多，体系中RCA产物的相对含量增加；同时，附着位点的增加导致dNTPs的消耗量增加，游离的dNTPs等其它物质的浓度降低，RCA产物的相对含量也不断提高，但引物过多时，反而由于多余的引物不能引发滚环扩增反应而游离在体系中，致使体系中RCA产物的相对含量降低。

4 结 论

滚环扩增反应是一种非常强大的等温核酸扩增技术，不管在生物学应用方面还是自组装方面都有着非常广泛的应用，合理地控制RCA产物的长度，可有助于我们估算出RCA产物重复单元的数量，通过化学计量的手段较为精确的计算出需要添加的互补链的数量，以提高组装的效率。本文通过以上几个考察因素的实验，发现在反应的前半个小时，时间对RCA产物的长度影响显著，半小时之后随着时间的增加变化不再明显。dNTPs的浓度对RCA产物的长度影响较大，增加dNTPs的浓度，RCA产物的长度会不断增长，至环状模板:dNTPs的摩尔浓度比为1 : 250时，RCA产物的长度则不再发生改变。酶和引物浓度对RCA产物的长度没有明显的影响，而时间、dNTPs浓度、引物浓度和酶浓度对RCA产物的浓度和含量都有一定的影响，特别是dNTPs的浓度越高RCA产物的浓度和含量越高。因此，可以通过控制反应的时间和dNTPs的浓度获得所需长度的RCA产物，通过合理调控酶和引物的浓度控制产物的浓度和含量，进行组装体的搭建和功能性的材料的制备，这既有利于后续反应的进行又降低了费用。

图5 引物对RCA产物的影响Fig.5 Effect of the primer concentration on RCA product.(a) An agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different concentrations of primer; (b) The UV-Vis spectra of RCA product at different concentrations of primer; (c) Comparison of analytical data for 260/280 and 260/230 at different concentrations of primer.

(1) Ali, M. M.; Li, F.; Zhang, Z. Q.; Zhang, K. X.; Kang, D.; Ankrum, J.A.; Le, X. C.; Zhao, W. A. Chem. Soc. Rev. 2014, 43, 3324.doi: 10.1039/c3cs60439j

(2) Terpe, K. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013, 97 (24), 10243.doi: 10.1007/s00253-013-5290-2

(3) Konry, T.; Smolina, I.; Yarmush, J. M.; Irimia, D.; Yarmush, M. L.Small 2011, 7 (3), 395. doi: 10.1002/smll.201001620

(4) Deng, Z. X.; Tian, Y.; Lee, S. H.; Ribbe, A. E.; Mao. C. D. Angew.Chem. Int. Ed. 2005, 44, 3582. doi: 10.1002/anie.200463096

(5) Wilner, O. I.; Shimron, S.; Weizmann, Y.; Wang, Z. G.; Willner, I.Nano Lett. 2009, 9 (5), 2040. doi: 10.1021/nl900302z

(6) Hamblin, G. D.; Carneiro, K. M. M.; Fakhoury, J. F.; Bujold, K. E.;Sleiman, H. F. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134 (6), 2888.doi: 10.1021/ja2107492

(7) Ouyang, X. Y.; Li, J.; Liu, H. J.; Zhao, B.; Yan, J.; Ma, Y. Z.; Xiao,S. J.; Song, S. P.; Huang, Q.; Jie Chao, J.; Fan, C. H. Small 2013, 9(18), 3082. doi: 10.1002/smll.201300458

(8) Yan, J.; Hu, C. Y.; Wang, P.; Liu, R.; Zuo, X. L.; Liu, X. W.; Song,S. P.; Fan, C. H.; He, D. N.; Sun, G. ACS Appl. Mater. Interfaces 2014, 6 (22), 20372. doi: 10.1021/am505913d

(9) Linck, L.; Reiß, E.; Bier, F.; Resch-Genger, U. Anal. Methods 2012,4, 1215. doi: 10.1039/c2ay05760c

(10) Xue, Q. W.; Wang, Z. G.; Wang, L.; Jiang, W. Bioconjug.Chem. 2012, 23 (4), 734. doi: 10.1021/bc200537g

(11) Akter, F.; Mie, M.; Grimm, S.; Nygren, P. Å.; Kobatake, E.Anal. Chem. 2012, 84 (11), 5040. doi: 10.1021/ac300708r

(12) Zhu, Y.; Wang, H. J.; Wang, L.; Zhu, J.; Jiang, W. ACS Appl.Mater. Interfaces 2016, 8 (4), 2573.doi: 10.1021/acsami.5b10285

(13) Zhao, W. A.; Cui, C. H.; Bose, S.; Guo, D.; Shen, C.; Wong,W. P.; Halvorsen, K.; Farokhzad, O. C.; Teo, G. S. L.; Philips,J.; Dorfman, D. M.; Karnik, R.; Karp, J. M. Proc. Natl. Acad.Sci. (USA) 2012, 109, 19626. doi: 10.1073/pnas.1211234109

(14) Chen, G.; Liu, D.; He, C. B.; Gannett, T. R.; Lin, W. B.;Weizmann, Y. J. Am. Chem. Soc. 2015, 137 (11), 3844.doi: 10.1021/ja512665z

(15) Zhang, Z. Q.; Ali, M. M.; Eckert, M. A.; Kang, D. K.; Chen,Y. Y.; Sender, L. S.; Fruman, D. A.; Zhao, W. A.Biomaterials 2013, 34, 9728.doi: 10.1016/j.biomaterials.2013.08.079

(16) Zhao, W. A.; Gao, Y.; Kandadai, S. A.; Brook, M. A.; Li, Y.F. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2409.doi: 10.1002/anie.200600061

(17) Wu, Z. S.; Zhou, H.; Zhang, S. B.; Shen, G. L.; Yu, R. Q.Anal. Chem. 2010, 82 (6), 2282. doi: 10.1021/ac902400n

(18) Kim, J. H.; Jang, M.; Kim, Y. J.; Ahn, H. J. J. Med. Chem.2015, 58 (19), 7863. doi: 10.1021/acs.jmedchem.5b01126

(19) Ye, T.; Chen, J. Y.; Liu, Y. F.; Ji, X. H.; Zhou, G. H.; He, Z.K. ACS Appl. Mater. Interfaces 2014, 6 (18), 16091.doi: 10.1021/am504035a

(20) Chen, A. Y.; Ma, S. Y.; Zhou, Y.; Chai, Y. Q.; Yuan, R. Anal.Chem. 2016, 88 (6), 3203.doi: 10.1021/acs.analchem.5b04578

(21) Ruff, L. E.; Marciniak, J. Y.; Sanchez, A. B.; Esener, S. C.;Messmer, B. T. Nanotechnol. Rev. 2014, 3, 569.doi: 10.1515/ntrev-2014-0010

(22) Liu, D. Y.; Daubendiek, S. L.; Zillman, M. A.; Ryan, K.; Kool,E. T. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118 (7), 1587.doi: 10.1021/ja952786k

(23) Zhu, G. Z.; Hu, R.; Zhao, Z. L.; Chen, Z.; Zhang, X. B.; Tan,W. H. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135 (44), 16438.doi: 10.1021/ja406115e

(24) Lieberman, K. R.; Cherf, G. M.; Doody, M. J.; Olasagasti, F.;Kolodji, Y.; Akeson, M. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132 (50),17961. doi: 10.1021/ja1087612

(25) Lu, J.; Chen, Y. H.; Liu, D. M.; Ren, W.; Lu, Y. Q.; Shi, Y.;Piper, J.; Paulsen, I.; Jin. D. Y. Anal. Chem. 2015, 87, 10406.doi: 10.1021/acs.analchem.5b02523

(26) Chen, X. Q.; Ye, Y.; Cheng, H.; Jiang, Y. W.; Wu, Y. J. Agric.Food Chem. 2009, 57, 5795. doi: 10.1021/jf9007696

(27) Bajaj, A.; Kondaiah, P.; Bhattacharya, S. Biomacromolecules 2008, 9, 991. doi: 10.1021/bm700930y

(28) Mohsen, M. G.; Kool. E. T. Acc. Chem. Res. 2016, 49 (11),2540. doi: 10.1021/acs.accounts.6b00417

(29) Lin, C. X.; Wang, X.; Liu, Y.; Seeman, N. C.; Yan, H. J. Am.Chem. Soc. 2007, 129, 14475. doi: 10.1021/ja0760980

Study on the Synthesis of DNA via Rolling Circle Amplification

LIU Shu-Zhen ZHANG Zhi-Qing＊WANG Fang ZHOU Ting WANG Xiu-Feng ZHANG Gou-Dong LIU Ting-Ting ZHANG Hong-Zhi
(School of Science, China University of Petroleum (East China), Qingdao 266580, Shandong Province, P. R. China)

Rolling circle amplification (RCA) is a simple and efficient isothermal enzymatic reaction,which has developed as a novel technology in the field of nucleic acid amplification. Its product has a wide range of applications in the assembly and preparation of multi-functional materials. Here, we report the effects of reaction time and the concentrations of deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs),polymerase, and primer on the product of RCA. The RCA product was characterized by methods including agarose gel electrophoresis, ultraviolet spectroscopy, and transmission electron microscopy (TEM). The results showed that the length of the RCA product was significantly affected by the reaction time,especially when the reaction time was less than 30 min. With an increase of dNTPs concentrations, the concentration and chain length of the RCA product increased. However, while the concentrations of enzyme and primer had little effect on the length of the RCA product, they had a large effect on its concentration. It is worth noting that the content of the RCA product decreased significantly in the presence of excess enzyme concentration.

Rolling circle amplification; Nucleic acid; dNTPs; Polymerase; Primer

March 29, 2017; Revised: May 2, 2017; Published online: May 10, 2017.

O648

10.3866/PKU.WHXB201750105 www.whxb.pku.edu.cn

＊Corresponding author. Email: zhangzq@upc.edu.cn; Tel: +86-532-86984568.

The project was supported by the Scientific Research Foundation for Returned Overseas Chinese Scholars (2014010615), National Natural Science Foundation of China (21603276, 21303267), Natural Science Foundation of Shandong Province, China (ZR2016BL14), and Fundamental Research Funds for the Central Universities, China.

教育部留学回国人员科研启动基金(2014010615), 国家自然科学青年基金(21603276, 21303267), 山东省自然科学基金(ZR2016BL14), 中央高校基本科研业务费资助项目

© Editorial office of Acta Physico-Chimica Sinica