黑枸杞提取物对HBV的抑制作用及抗氧化能力测定

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(1.桂林医学院药学院,广西桂林 541004;2.广西肝脏损伤与修复分子医学重点实验室,广西桂林 541004)

慢性乙型肝炎是乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染所导致的肝脏疾病,随着疾病的进展,最终演变为肝功能异常、肝硬化或甚至肝癌。全球乙肝病毒携带者有3.5～4亿人,中国为乙型肝炎高流行区,HBV携带者约有1.3亿,慢性肝炎患者约3000万人[1]。用以拉米夫啶、恩替卡韦等为代表的核苷类药物抗乙肝病毒治疗是目前临床上公认的治疗方案,但是长期用药导致耐药病毒株日益增多,HBV病毒学反弹,药物治疗不良反应多等现象[2]。肝脏的主要功能是代谢,但同时它也有着去氧化的作用。国内外研究表明肝脏负荷过大,去氧化能力下降导致肝脏被自由基损伤也与肝脏疾病的发生和发展有着很大的关系[3]。因而,寻求新的治疗方案和开发更安全有效的药物对患者进行抗炎保肝、抗病毒、清除自由基和免疫调节综合治疗是一种趋势。

黑枸杞(LyciumruthenicumMurr)藏药称“旁玛”,为茄科枸杞属灌木植物,具棘刺,分布于我国西北地区[4]。研究发现,黑枸杞有抗血脂、降血糖、免疫调节、延缓衰老、预防及治疗心血管疾病的应用价值[5]。本实验运用大孔吸附树脂对黑枸杞分离提纯,得到黑枸杞提取物[6],其提取物具有降低肝脏中脂肪含量及保肝[7]、抗肿瘤[8]、抗氧化活性[9]等多种药理学效应。

研究显示很多植物药具有良好的抗乙肝功效,例如盐酸千金藤碱[10]、绿茶儿茶素[11]、甘草提取液[12]、天花粉水提物[13]等多种天然药物均有抗HBV作用,但黑枸杞提取物是否有抗乙肝作用尚未见报道。本实验通过研究黑枸杞提取物对体外HepG22.2.15细胞模型分泌HBsAg和HbeAg的影响,从细胞水平上观测和评价其抗HBV作用。并通过检测黑枸杞提取物的·OH 的清除率、DPPH· 的清除率、还原能力来测定其抗氧化能力。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

黑枸杞干果 购买于甘肃;DMEM高糖培养基、G418 美国Gibco公司;胎牛血清 奥地利PAA公司;谷氨酰胺 美国Sigma公司;HBsAg、HBeAg试剂盒 中国上海科华生物工程股份有限公司;MTT试剂盒 美国Amresco公司;HepG22.2.15细胞系 北京大学医学院第一附属医院病毒研究所;拉米夫定 英国葛兰素史克制药有限公司;硫酸亚铁、铁氰化钾 分析纯,中国国药集团化学试剂有限公司;氯化铁、过氧化氢 分析纯,中国西陇科学股份有限公司;抗坏血酸 中国山东佰仟化工有限公司;DPPH标准品 中国梯希爱化成工业发展有限公司。

二氧化碳培养箱 日本三洋公司;XSBIA倒置显微镜 中国上海蔡康光学仪器有限公司;超净工作台 中国天津尘埃净化设备厂;细胞培养瓶、96孔细胞培养板 美国Corning公司;酶联免疫检测仪 美国BioTek公司;MVExc47/11-6液氮存贮灌 美国MVE公司。

1.2实验方法

1.2.1 黑枸杞提取物的制备 称取经干燥粉碎的黑枸杞粉末20 g,并按照固液比1∶10用55 ℃超纯水浸提,过D101大孔树脂,70%乙醇洗脱,-0.1 MPa下减压回收乙醇并冷冻干燥得到黑色结晶粉末[14]。

1.2.2 黑枸杞提取物体外抗乙肝病毒实验

1.2.2.1 细胞培养与药物分组 培养基制备:DMEM 中加入380 mg·L-1G418,15%胎牛血清,2 mmol·L-1谷氨酰胺,1%青、链霉素,5%碳酸氢钠并且调节pH7.2～7.4。HepG22.2.15细胞以1×104mL接种于96孔板,培养24 h后加药。黑枸杞提取物用培养基溶解,无菌过滤,稀释为不同质量浓度:100、50、25、12.5 mg/L,分组加入96孔板中,在同等条件下,设无血清培养基并且不加黑枸杞提取物组为阴性对照组,拉米夫定组(终质量浓度100、50、25、12.5 mg/L)为阳性对照。加药后每3 d收集上清液一次,再加入新的含药培养基,共孵育9 d。收集的第3、6、9 d上清液于-20 ℃冰箱保存待测[15]。

1.2.2.2 黑枸杞提取物细胞毒性实验(MTT法) 体外培养HepG22.2.15细胞用于检测黑枸杞提取物的细胞毒作用。细胞接种于96孔板,每孔190 μL,加入药物处理9 d。第9 d收集上清液后加入新的培养基190 μL,每孔加入20 μL MTT,37 ℃、5% CO2的培养箱再培养4 h。弃掉上清液,每孔加入150 μL DMSO溶解孔内生成的MTT-甲瓒,用酶联免疫检测仪在490 nm波长检测各孔吸光度值,对各孔细胞生成的甲瓒进行定量。与对照组(细胞存活率100%)进行比较,计算出各孔细胞存活率,以判断药物的细胞毒性作用。

细胞存活率(%)=(实验孔A值/对照孔A值)×100[16]

1.2.2.3 检测黑枸杞提取物对HepG22.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响 根据双抗体夹心ELISA试剂盒说明测定 HepG22.2.15细胞上清液HBsAg和HBeAg的表达。计算药物对HBsAg和HBeAg分泌的抑制率。

抑制率(%)=(N-P)/(N-空白)×100

式中,N为阴性对照孔A值;P为实验对照孔HbsAg或HbeAg的A值;空白为空白孔A值。

1.2.3 黑枸杞提取物的抗氧化活性的测定

1.2.3.1 不同浓度提取物对羟自由基(·OH)的清除能力测定 通过Fenten反应产生· OH,在试管中依次加入9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液100 μL,9 mmol/L的FeSO4100 μL,黑枸杞提取物分别配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/mL溶液不同浓度提取物100 μL,8.8 mmol/L H2O21 mL启动整个反应。37 ℃水浴加热15 min,然后离心机4000 r/min离心3 min。最后在510 nm下测定吸光度并设为A1。用100 μL蒸馏水代替FeSO4重复实验得到A2,用100 μL去离子水代替提取物重复实验得到A3。用抗坏血酸作为阳性对照,最后按下式计算羟基自由基的清除率:

·OH的清除率(%)=[A3-(A1-A2)]/A3×100

DPPH·的清除率(%)=[A3-(A1-A2)]/A3×100

1.2.3.3 不同浓度提取物还原能力的测定 黑枸杞提取物分别配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的溶液。将250 μL pH6.6磷酸钠缓冲液(0.2 mol/L)和250 μL 1%的铁氰化钾溶液混合,取待测提取物溶液50 μL加到混合液中,在50 ℃条件下保温20 min,加入250 μL 10%的三氯乙酸,3000 r/min离心10 min,最后取上清液250 μL,与250 μL 2.5 mL蒸馏水和100 μL 0.1%的氯化铁混合,10 min后在700 nm下测定吸光值,用抗坏血酸作为阳性对照,吸光度值与还原能力呈正比例关系。

表2 黑枸杞提取物对HepG2 2.2.15细胞HBsAg表达的影响Table 2 Effects of black wolfberry extracts on HBsAg expression in HepG2 2.2.15 cells(±s,n=3)

注:与阴性对照组比较,*p<0.05;表3同。

1.3数据处理

2 结果与分析

2.1黑枸杞提取物对HepG22.2.15细胞毒性作用

用MTT法检测黑枸杞提取物对HepG22.2.15细胞增殖的影响。黑枸杞提取物孵育细胞9 d后,结果显示黑枸杞提取物对HepG22.2.15细胞无细胞毒作用,各浓度细胞存活率均>100%,随着浓度的增加细胞呈增生趋势。而阳性对照组拉米夫啶在50～100 mg/L对HepG22.2.15细胞有一定毒性作用。提示黑枸杞提取物可促进HepG22.2.15细胞的增长,结果见表1。

表1 黑枸杞提取物对HepG22.2.15细胞的毒性作用(n=3)Table 1 Cytotoxic effects of black wolfberry extracts on HepG22.2.15 cells(n=3)

2.2黑枸杞提取物对HBsAg和HBeAg表达影响

黑枸杞提取物作用于细胞后,可抑制HepG22.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌。黑枸杞提取物高浓度和中浓度对HepG22.2.15细胞HBsAg表达的抑制率呈递增趋势。高质量浓度100 mg/L第3、6、9 d对HBsAg的抑制率分别是8.20%、38.78%、53.22%。质量浓度50 mg/L第3、6、9 d对HBsAg的抑制率分别是-16.80%、-5.2%、11.53%,实验结果分析说明,黑枸杞提取物在第9 d最高质量浓度100 mg/L对HepG22.2.15细胞HBsAg有抑制作用,其在质量浓度50 mg/L时对HepG22.2.15细胞HBsAg的表达抑制作用弱,前中期第3、6 d对HepG2 2.2.15细胞HBsAg的表达可能还有促进作用。阳性对照组拉米夫定对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用弱,最高质量浓度100 mg/L第9 d对HBsAg和HBeAg抑制率为17.37%、27.10%,这与本实验室以前的实验结果[18]及李桂秋、刘江霞报道的结果一致[19-20]。结果见表2。

黑枸杞提取物高质量浓度和中质量浓度对HepG22.2.15细胞HBeAg表达的抑制率也呈递增趋势。最高质量浓度100 mg/L第3、6、9 d对HBeAg的抑制率分别是41.67%、60.45%、72.83%。在质量浓度50 mg/L第3、6、9 d对HBeAg的抑制率分别是13.34%、14.62%、47.31%,见表3。根据实验结果分析说明黑枸杞提取物在第6、9 d最高质量浓度100 mg/L对HepG22.2.15细胞HBeAg的表达有明显抑制作用,而在质量浓度50 mg/L时对HepG22.2.15细胞HBeAg的表达抑制作用弱,在质量浓度25 mg/L时,前中期第3、6 d对HepG22.2.15细胞HBeAg的表达可能还有促进作用。结果见表3。

2.3黑枸杞提取物的抗氧化活性

2.3.1 不同浓度提取物对羟自由基(·OH)的清除能力 由图1可知,黑枸杞提取物浓度与抗坏血酸清除率呈正相关的关系。在相同浓度下,抗坏血酸对·OH的清除率要高于黑枸杞提取物对·OH 的清除率。抗坏血酸IC50值为1.501 mg/mL,黑枸杞提取物IC50值为26.559 mg/mL。图1中黑枸杞提取物浓度为5.0 mg/mL时清除率最高,为21.07%。由此可知黑枸杞提取物有羟自由基清除能力,但在同等浓度条件下要低于阳性对照抗坏血酸。

表3 黑枸杞提取物对HepG22.2.15 细胞HBeAg表达的影响Table 3 Effects of black wolfberry extracts on HBeAg expression in HepG2 2.2.15 cells(±s,n=3)

图1 黑枸杞提取物对羟自由基(·OH)的清除能力Fig.1 Scavenging effects on hydroxyl radical (·OH)of black wolfberry extracts

2.3.2 不同浓度提取物对DPPH自由基(DPPH·)清除能力 由图2可知,黑枸杞提取物浓度的DPPH·的清除率较高。当黑枸杞提取物在0.05～0.15 mg/mL浓度范围内时,其对DPPH·的清除能力明显高于阳性对照抗坏血酸。抗坏血酸IC50值为0.276 mg/mL,图中黑枸杞提取物浓度为0.30 mg/mL清除率最高,为97.25%。所以,黑枸杞提取物具有良好的清除DPPH·能力。

图2 黑枸杞提取物对DPPH自由基(DPPH·)清除能力Fig.2 Scavenging effects on DPPH free radical(DPPH·)of black wolfberry extracts

2.3.3 不同浓度提取物的还原能力 由图3可知,黑枸杞提取物的还原能力随着浓度的增加而逐渐增强。但是在相同浓度下,抗坏血酸的还原能力要高于黑枸杞提取物对的还原能力。图中黑枸杞提取物浓度为3.0 mg/mL时清除率最高,为1.440。因此黑枸杞提取物有还原能力,但同等浓度条件下要低于阳性对照抗坏血酸。

图3 黑枸杞提取物的还原能力Fig.3 Reducing power of black wolfberry extracts

3 结论

在研究中发现,黑枸杞提取物在体外对HepG22.2.15细胞没有毒性作用,可抑制HepG22.2.15细胞HBsAg和HBeAg的表达,具有明显的量效和时效关系。同时,黑枸杞提取物有清除·OH和DPPH·的能力和还原能力,随着提取物浓度的增加其清除能力与还原能力逐渐增强。实验结果与闫亚美等证实黑枸杞提取物抗氧作用基本一致[21]。花青素是黑枸杞的有效成分和呈色的物质[22],所以黑枸杞是天然的自由基清除剂,其抗氧化活性与花青素有关,对肝脏有一定的保护作用,其提取物抗病毒的有效成分和原理值得进行进一步研究。

本实验中所用的阳性药物拉米夫定主要是通过抑制HBV DNA的表达[12]发挥治疗乙肝的作用,实验数据显示其对HepG22.2.15细胞中HBsAg和HBeAg的分泌抑制作用不强。本实验结果与Kruining等[23]和WillIan等[24]报道拉米夫HepG22.2.15细胞中基本不影响HBsAg和HBeAg的分泌相同。在低浓度(12.5、25 mg/L)的时候,反而似乎有促进抗原表达的现象,但这现象随着用药时间的沿长,呈降低趋势,在任衍菊等[25]的报道中也有类似现象。考虑是药物浓度相对低并且作用间短的情况下,受到细胞种板密度和细胞生长速度较快等因素影响造成。

综上所述,黑枸杞提取物能抑制乙肝病毒,并且有着良好的抗氧化保肝作用,可在后续研究中进一步分离提取找到活性单体成分,探讨其体内外抗HBV机制,为抗乙肝药物研发提供参考。

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