发酵条件对桑椹果酒中挥发酸的影响

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(1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡 643000;2.四川化工职业技术学院，四川泸州 646000;3.川北医学院基础医学院，四川南充 637000)

桑椹(Mulberry)富含糖分、有机酸、游离氨基酸、维生素及微量元素,是一种极富营养价值和保健功能的水果[1-2]。桑椹果酒是以新鲜桑椹和桑椹汁为原料,利用酵母菌将糖经发酵转化为酒精等产物,再经陈酿成为酒质醇厚芳香、酒体清亮透明的果酒产品[3]。目前,在桑椹果酒生产过程中,普遍出现挥发酸含量偏高的现象,影响果酒的品质。研究发现,果酒中的挥发酸是各种低沸点酸及其衍生物的总和,其主要组分为醋酸[4]。桑椹果酒中挥发酸的形成主要分为以下几个方面原因:一是高糖诱导的渗透压胁迫酵母生成乙酸等副产物,导致挥发酸含量升高[5];其次是在桑椹果酒发酵过程中,由于温度和pH选择不当,影响了酵母菌体内酶的活性,使反应向生成挥发酸的方向进行,从而生成大量挥发酸;最后是发酵菌株也会影响挥发酸的生成。挥发酸作为评价果酒质量的重要指标,首先其含量过高,影响桑椹果酒口感和品质;其次是挥发酸被认为是一种损害性物质,桑椹果酒中挥发酸过量,将给人带来尖酸感和不愉快的醋味,故其含量应该被控制在较低水平[6];再次是在桑椹果酒发酵过程中,挥发酸含量过高,影响酵母的发酵性能,造成发酵异常[7]。针对果酒挥发酸易超标的问题,杨华峰[8]等对冰红酒进行相关研究,结果表明葡萄汁初始糖度和SO2添加量明显影响冰红酒发酵过程中挥发酸的产生和积累。裴广仁[9]等对冰葡萄酒的研究表明,初始糖度、发酵温度与挥发酸生成量呈显著正相关,酵母种类也会影响挥发酸的生成量。为控制桑椹果酒发酵过程中挥发酸含量,解决桑椹果酒挥发酸超标的问题,本文以挥发酸为主要指标,通过单因素、正交实验优化桑椹果酒发酵工艺,研究发酵条件对桑椹果酒中挥发酸的影响,旨在为桑椹果酒的酿造提供数据支撑,也为挥发酸的进一步研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

桑椹 购至四川某农场;菌种:活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;PDA液体培养基、YPD固体培养基 实验室自制。

GZ-250-HS11恒温恒湿箱 韶关市广智科技设备有限公司;YXQ-LS-75S11立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;LB20T手持糖度计 成都格纳丝商贸有限公司;27000005-1酒精计 沈丘北郊玻璃仪器厂;XSP-42光学显微镜 广州新怡光学显微镜厂家;气相色谱-质谱联用仪(Agilent 6890N-5975B) 美国安捷伦公司;手动SPME进样器50/30UM DVB/CAR/PDMS固相微萃取头 上海安谱科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 工艺流程 桑椹果实→选果→洗果→破碎打浆(加入0.02～0.03%(W/W)果胶酶)→成分调整(添加白砂糖)→主发酵→分离→后发酵→初滤→调整→陈酿→澄清→精滤→装瓶→杀菌[10]

1.2.2 操作要点 将桑椹置于室温解冻,破碎打浆得桑椹汁,向桑椹果醪中添加一定量的白砂糖以调整果醪糖度;按比例接入酵母种子液于桑椹果醪中,将发酵醪置于一定温度下发酵7 d,发酵过程中进行搅拌以便完全发酵;发酵结束时进行倒罐,并根据果醪糖度和酒精度,补加白砂糖,使最终酒度在10%vol左右,封罐进入后发酵,发酵8～10 d至残糖含量小于4 g/L;经后发酵的桑椹果酒密封陈酿3～6个月;陈酿结束后,将桑椹果酒经板框过滤机过滤、装瓶并进行巴氏灭菌。

1.2.3 种子液的制备及接种发酵 称取0.3 g安琪活性干酵母于100 mL PDA液体培养基中,置于28 ℃,120 r/min摇床培养。在此过程中,对酵母进行平板计数,当菌体浓度达到1×108数量级时,接种发酵。

1.2.4 单因素实验 分别选取糖度、温度、pH和酵母接种量等单因素,进行桑椹果酒发酵实验。

1.2.4.1 糖度 向锥形瓶中加入桑椹果醪200 mL,调节果醪pH4.0,酵母接种量6%,发酵温度24 ℃,果醪糖度分别为140、160、180、200、220 g/L,发酵7 d。发酵结束时,分别测定发酵液的挥发酸含量、酒精度。

1.2.4.2 温度 向锥形瓶中加入桑椹果醪200 mL,调节果醪糖度180 g/L,pH4.0,酵母接种量6%,发酵温度分别为22、24、26、28、30 ℃,发酵7 d。发酵结束时,分别测定发酵液的挥发酸、酒精度。

1.2.4.3 pH 向锥形瓶中加入桑椹果醪200 mL,调节果醪糖度180 g/L,发酵温度24 ℃,酵母接种量6%,pH分别调至3.50、3.75、4.00、4.25、4.50,发酵7 d。发酵结束时,分别测定发酵液的挥发酸、酒精度。

1.2.4.4 接种量 向锥形瓶中加入桑椹果醪200 mL,调节果醪糖度180 g/L,pH4.0,发酵温度24 ℃,酵母接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%,发酵7 d。发酵结束时,分别测定发酵液的挥发酸、酒精度。

1.2.5 正交实验 在单因素实验基础上,设计L9(34)正交实验,以挥发酸和酒精度为考察指标,研究发酵条件对桑椹果酒挥发酸的影响,正交实验因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.6 桑椹果酒中挥发性风味物质的提取 取10 mL最佳发酵工艺条件下桑椹果酒样品于15 mL顶空瓶,加入1 g NaCl,置于恒温磁力搅拌加热平台上。桑椹酒样预热10 min,将萃取头伸入顶空部分,于45 ℃下吸附40 min后拔出,插入气相色谱进样口,于230 ℃热解析3 min。

1.2.7 桑椹果酒中挥发性风味物质的GC-MS分析

1.2.7.1 色谱条件 DB-WAX毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 um);载气:高纯度氦气,流速1 mL/min;无分流进样;进样口温度为230 ℃;升温程序:起始柱温35 ℃,保持3 min,以6 ℃/min的速率升温到150 ℃,保持1 min,再以12 ℃/min的速率升温到230 ℃,保持3 min;

1.2.7.2 质谱条件 电子轰击离子源(EI);电子能量70 eV;扫描质量:20～550 u;离子源温度230 ℃;接口温度230 ℃。

1.2.7.3 桑椹果酒挥发性风味物质的定性定量分析 利用GC-MS分析所得全离子图谱,结合保留时间,运用NIST 05标准谱库进行初步检索,对桑椹果酒中的挥发性物质进行定性分析,并采用峰面积归一化法确定各挥发性风味成分的相对含量[11]。

1.2.8 分析方法 酒精度:酒精计法;总酸:电位滴定法;挥发酸:蒸馏法;pH:pH计直接测定;残糖:费林试剂法[12]。

1.3数据统计分析

根据正交实验结果,分别计算酒精度和挥发酸隶属度。

酒精度隶属度=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin),式中X为待计算隶属度的酒精度值,Xmax为正交实验中最大酒精度值,Xmin为正交实验中最小酒精度值。

挥发酸隶属度=(Ymax-Y)/(Ymax-Ymin),式中Y为待计算隶属度的挥发酸值,Ymax为正交实验中最大挥发酸值,Ymin为正交实验中最小挥发酸值。

桑椹果酒中挥发酸权重[13]取0.6,酒精度的权重取0.4,分别对不同发酵条件下的桑椹果酒进行综合评分,即综合评分=酒精度隶属度×0.4+挥发酸隶属度×0.6,并采用IBM SPSS Statistics 19对评分结果进行方差分析。

2 结果与分析

2.1糖度对桑椹果酒挥发酸的影响

糖度不仅影响成品果酒的酒精含量,对果酒中挥发酸的产生也发挥着重要作用。由图1可知,随着糖度的增加,酒精度呈逐渐上升趋势,挥发酸先降低后升高,当糖度在160 g/L时,挥发酸最低。在低糖条件下,酵母能进行正常的酒精代谢,桑椹果酒中挥发酸的含量相对较低,当糖度超过160 g/L时,高糖形成的高渗透压胁迫酵母发生不完全发酵形成挥发酸等副产物,导致桑椹果酒中挥发酸逐渐上升。结合挥发酸和酒精度的含量变化情况,当糖度在160 g/L左右条件下,在保证桑椹果酒正常发酵效果的情况下,挥发酸含量最低。

图1 糖度对桑椹果酒挥发酸的影响Fig.1 The effects of sugar content on volatile acidity of mulberry wine

2.2温度对桑椹果酒挥发酸的影响

由于微生物的生长、繁殖和代谢需要适宜的温度环境。因此在桑椹果酒发酵过程中,温度的控制极为重要,温度选择不适会造成发酵过程中酵母菌受温度胁迫而出现发酵缓慢、迟滞及产生不良代谢副产物,引起挥发酸含量增大[14-15]。

由图2可知,随着发酵温度的上升,挥发酸先下降后上升,酒精度先升高后降低,且当发酵温度控制在24 ℃时,挥发酸含量最低,酒精度达到最高。其原因可能是酒精发酵途径中乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶的最适酶活温度在24 ℃左右,当温度升高,菌体内酶活性发生变化,导致酒精发酵不能正常进行,使反应向生成挥发酸的途径进行,从而使桑椹果酒酒精含量降低,挥发酸含量升高。因此当发酵温度控制在24 ℃左右时,在保证桑椹果酒正常发酵效果的情况下,挥发酸含量最低。

图2 温度对桑椹果酒挥发酸的影响Fig.2 The effects of temperature on volatile acidity of mulberry wine

2.3pH对桑椹果酒挥发酸的影响

微生物的繁殖、代谢普遍受pH的影响,在桑椹果酒发酵过程中,酵母菌体内酶系组成与发酵液pH密切相关,随着pH的变化,酵母菌体内酶系组成和活性随之发生改变,其代谢产物也会发生相应的变化[16]。

由图3可知,随着pH的升高,挥发酸先下降后上升,酒精度先升高后降低。由于在通常情况下,桑椹果酒的pH维持在3.70～3.80的范围内,过高或过低的pH会影响酵母菌体内酶系组成及其活性,导致酵母菌酒精代谢途径被抑制,而挥发酸代谢途径的酶促反应得到加强,从而使桑椹果酒酒精度降低,挥发酸升高。结合挥发酸和酒精度的含量,当发酵初始pH在4.00左右时,在保证桑椹果酒正常发酵效果的情况下,挥发酸含量最低。

图3 pH对桑椹果酒挥发酸的影响Fig.3 The effects of pH on volatile acidity of mulberry wine

2.4酵母接种量对桑椹果酒挥发酸的影响

在桑椹果酒发酵过程中,酵母接种量过少,达不到理想的发酵效果,接种量过高,酵母会消耗发酵液中的糖用于自身的生长、繁殖,从而影响果酒的酒精含量[17]。另外,由于酵母菌自身生长繁殖会消耗部分营养物质,使酵母菌正常的酒精代谢途径受到影响,从而形成挥发酸等产物。

表2 正交实验结果Table 2 The results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 The analysis of variance

由图4可知，当酵母接种量不超过4%时，挥发酸和酒精度变化不大，当接种量大于4%时，挥发酸迅速上升而酒精度降低。其原因可能是当接种量较小时，酵母菌利用糖进行正常的酒精发酵,当接种量过高时,酵母菌争夺营养物质用于自身的生长、繁殖,生成挥发酸等产物,从而导致酒精度降低,挥发酸升高。因此结合挥发酸和酒精度含量,当酵母菌接种量在4%左右时,在保证桑椹果酒正常发酵效果的情况下,挥发酸含量最低。

图4 酵母接种量对桑椹果酒挥发酸的影响Fig.4 The effects of inoculum concentration on volatile acidity of mulberry wine

2.5正交实验结果

根据单因素实验结果,进行L9(34)正交实验,正交实验结果及方差分析分别见表2与表3。

通过极差和方差分析,对桑椹果酒发酵结果影响大小依次为:pH、糖添加量、温度、酵母接种量,pH对桑椹果酒影响显著,从理论上得桑椹果酒最佳发酵工艺条件为:A3B3C2D2,即糖度180 g/L,温度28 ℃,pH4.25,接种量4%。在理论最佳发酵工艺条件下进行验证实验,同时以正交实验最优组进行对照,得理论最佳发酵工艺条件下桑椹果酒挥发酸为1.32 g/L,酒精度为10.5%vol,其综合评分为0.93,优于对照组的综合评分0.89,从而得桑椹果酒最佳发酵工艺条件为A3B3C2D2。

2.6桑椹果酒挥发性风味物质成分分析

在桑椹果酒发酵工艺优化的基础上,采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱鉴定最佳发酵工艺条件下桑椹果酒中挥发性风味物质成分,以探究最佳发酵工艺对桑椹果酒中挥发性风味物质的影响。GC-MS色谱图如图5所示,桑椹果酒挥发性风味物质成分如表4所示。

图5 桑椹果酒挥发性成分总离子图谱Fig.5 The total volatile components ion spectra of mulberry wine

表4 桑椹果酒挥发性风味物质成分Table 4 The volatile composition of mulberry wine

由表4可知,从桑椹果酒中共检测出29种挥发性风味物质,其中醇类物质10种,是桑椹果酒中最主要的风味物质,酯类物质10种,其含量仅次于醇类,其他挥发性物质9种,三类物质的相对含量分别占总挥发性物质的92.413%、5.315%、1.079%。醇类物质中苯乙醇含量较高,赋予桑椹酒独特的香气,酯类物质赋予桑椹酒浓郁的果香、花香,其中贡献较大的是乙酸乙酯,辛酸乙酯和丙酸苯乙酯,这与商敬敏[18]等人确定的醇类、酯类为桑椹果酒中主要风味成分的研究结果一致。实验结果表明,在最佳工艺即糖度180 g/L,温度28 ℃,pH4.25,酵母菌接种量4%条件下,在保证降低桑椹果酒挥发酸的情况下,桑椹果酒的挥发性风味成分丰富,桑椹果酒发酵工艺的优化取得了较好的效果。

3 结论

本文采用安琪酵母进行桑椹果酒发酵实验,探究发酵条件对桑椹果酒中挥发酸的影响。通过单因素和正交实验,得到桑椹果酒最佳发酵工艺条件为:糖度180 g/L,温度为28 ℃,pH4.25,酵母菌接种量4%。在此条件下进行验证实验,测得桑椹果酒中挥发酸含量为1.32 g/L,酒精度达到10.5%vol,其综合评分为0.93,将验证实验与正交实验进行比较,结果表明A3B3C2D2为最优组合。通过对桑椹果酒挥发性

风味成分的分析,在此条件下,果酒中主要的风味成分为醇类和酯类,赋予桑椹酒独特的果香和酯香。

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