半边莲生物碱类物质鉴定及对Hela细胞抑制作用研究

孙 尧，张 皓，孙佳明，张 辉*，高晓晨*

（1.长春工业大学，长春 130012；2.吉林省经济管理干部学院，长春 130012；3.长春中医药大学，长春 130117）

半边莲是桔梗科（Campanulaceae）半边莲属（Lobelia L.）植物半边莲（Lobelia chinensis）的带根全草，在我国安徽、福建、广东、广西、贵州、海南均有生长。我国《中华本草》记载半边莲有祛痰、止咳、增强免疫力等功效[1-4]。目前，我国的半边莲属植物的研究较少，主要停留在中草药配伍方面的研究。生物碱是药物常见的化学成分，同时作为被视为现代药物的最主要来源之一，生物碱是一类常见于植物中的主要含氮有机化合物[5-8]。大部分生物碱类化合物成分具有抗肿瘤、抗感染抗菌等药理活性[9-10]。本研究主要针对半边莲的生物碱类化学成分，对其化学结构及抗肿瘤活性进行研究，以期为半边莲的化学成分鉴定及其在抗肿瘤研究中的开发和应用提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂 半边莲药材采由长春中医药大学提供。1640培养液（美国Hyclone公司产品），胎牛血清（康源生物公司产品），细胞培养板（英国NEB公司产品），牛血清白蛋白及MTT均由实验室保存。所用试剂均为分析纯。

1.2 分离和测试用仪器 Acquity UPLC-Synapt G2 MS色谱质谱联用仪（Waters公司产品），LTQ型离子阱质谱仪（美国Thermo Fisher公司产品），高速逆流色谱仪（TBE 20上海同田生化技术有限公司产品），Eppendorf centrifuge 5810R 台式高速大容量离心机（德国Eppendorf公司产品），GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备产品），DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司产品），KQ5200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司产品），BS110S电子天平（德国赛多利斯股份公司产品），T-500型电子天平（美国双杰兄弟有限公司产品），酶标仪（ELX80 美国BIOTEK公司产品）。

2 实验方法

2.1 半边莲生物碱类化学成分的提取 取干燥的半边莲全草0.5 kg进行粉碎，用5 L乙醇（95%）乙醇溶液超声溶解，将乙醇溶液旋转蒸发提取2次，每次旋蒸提取时间为3 h，提取溶液回收后进行冷冻干燥，冷冻干燥96 h。冷冻干燥成粉末后，取1 mg半边莲冻干粉经过超声溶解法溶于10 mL正丁醇中，溶解后将10 mL正丁醇经氮吹仪吹干，将吹干后的溶质，溶于10 mL甲醇中制成制备液，用于后续检测。

2.2 半边莲生物碱类化学成分质谱分析 Finnigan LTQ质谱仪：毛细管温度250℃；喷雾电压 4.0 kV，透镜电压 -250 V；毛细管电压 -4 V；质量检测范围 m/z：200～1 500；注射泵流速 5 μL/min；鞘气为氮气流速40 mL/min。

色谱柱为Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；进样体积为10 μL；流动相流速为0. mL/min；柱温为20℃，流动相A：0.1%甲酸水；流动相B：乙腈；流动相C：甲醇。

2.3 单体生物碱的提取 根据分离生物碱的性质及生物碱甲醇溶液极性的大小，采用分析型HSCCC确定选用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6:3:2:5，V/V）体系。经过超声脱气30 min后，在紫外波长254 nm下进行检测。

采用制备型HSCCC进行分离制备。固定的流速20 mL/min，泵入HSCCC管柱中，管柱中流出50 mL后停泵，运行主机，调整流动相，使之达到两相溶剂动态平衡，50 mL待分离样品注入HSCCC 仪中，分离生物碱单体组分。紫外检测波长柱温25 ℃。根据色谱图收集各组分。

2.4 Hela细胞培养 将细胞从- 80 ℃冰箱中迅速取出，置于37 ℃水浴锅中，待细胞解冻后，浆细胞悬浮液加入15 mL离心管中，再向离心管中加入4 mL细胞培养液，1 000 r/min离心3 min后，弃上清，加入1 mL培养液吹匀，置于培养皿中，培养皿体系为9 mL培养液和1 mL血清。

待细胞在培养皿中铺满80%以上面积时，将皿中培养基全部弃掉，加入2 mL胰酶，37℃消化2～5 min，待皿中细胞不再贴壁时，加入1 mL血清和3 mL培养基吹起，加入15 mL离心管中离心，将沉淀用3 mL培养液吹起，平均分成3份，分入3个皿中，继续培养。

2.5 Hela细胞MTT实验 10%胎小牛血清加入到96孔板中，每孔加入1 000～10 000个胎牛血清得细胞悬浮液，每孔加入200 μL。待细胞完全贴壁后，每孔加入终浓度为1 mg/mL的各种中药，继续培养24 h。

培养24 h后，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配制，pH = 7.4）20 μL继续孵育4 h，吸取上清液并弃掉，每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。酶标仪以490 nm波长检测，各孔光吸值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。抑制率/% =（对照组OD值－测试组OD值）/对照组OD值×100

3 实验结果

3.1 半边莲主要生物碱类化学成分分析 如图1所示，在正离子模式下共鉴定出5个主要的化合物离子峰。对以上峰1～5峰进行二级谱碎裂MS/MS分析显示，根据保留时间及二级普特征碎片及相关文章参考，鉴定出化合物2，3，4，5为8，10-二乙基山梗酮，新山梗菜碱B，新山梗菜碱A及山梗新碱如表1所示，其主要碎裂方式为失去1分子2-丁酮（72 Da），失去1分子丙酮（58 Da），或失去1分子甲基（14 Da），化合物1为未知化合物，根据二级普碎裂方式推测可能结构式如图2所示。

3.2 新山梗菜碱B和新山梗菜碱A逆流色谱提取 本研究采用HSCCC提取含量较高的新山梗菜碱B和新山梗菜碱A2种生物碱，分别得到5 mL新山梗菜碱B和5 mL新山梗菜碱A溶液，以硫酸山梗碱为标品，采用紫外分光光度计，绘制硫酸山梗碱含量标准曲线，通过制硫酸山梗碱标准曲线计算新山梗菜碱B和新山梗菜碱A含量，新山梗碱B含量为3.2 mg/mL，新山梗菜碱A含量为2.4 mg/mL。5 mL新山梗菜碱B和新山梗菜碱A经氮吹后。加水配置1 mg/mL的溶液以备Hela细胞MTT检测用。

图1 梗菜中主要生物碱类化合物总离子流图

图 2 定出山梗菜的主要生物碱化学结构式及碎裂方式，红色虚线表示MS/MS特征碎片化学键断裂方式

3.3 半边莲提取物及其单体生物碱对Hela细胞MTT检测 为了确定半边莲提取物及其单体生物碱样品是否对Hela细胞的生长具有抑制作用，笔者对梗菜提取物及其单体生物碱样品对Hela细胞进行MTT检测。如表2所示，MTT实验中加入半边莲提取物及其单体生物碱样品后，对Hela细胞生长具有抑制作用。其中培养24 h后，抑制率达到最高。同时可以看出半边莲醇提取物对Hela细胞生长的抑制效果不如相同浓度下半边莲单体生物碱对Hela细胞生长的抑制率，所以可以确定山梗菜中的生物碱对Hela细胞癌症模型起抑制作用，且半边莲中起决定抗肿瘤效果的是半边莲中的生物碱成分，其中新山梗菜碱A对肿瘤细胞的抑制率略高于新山梗菜碱B。

表1 山梗菜中主要生物碱鉴定

表2 1 mg/mL样品对Hela细胞生长抑制率

4 结论

本研究采用乙醇回流提取法及正丁醇萃取法，提取出半边莲中的主要活性成分，通过UPLC-MS及ESI-MS2的方法，共鉴定出5种半边莲中主要生物碱成分，通过二级谱碎裂及保留时间及相关文献的查阅确定5种生物碱为8，10-二乙基山梗酮，新山梗菜碱B，新山梗菜碱A，山梗新碱及一种未知生物碱并推测及结构式，通过HSCCC提取主要的2种生物碱新山梗菜碱B和新山梗菜碱A。并通过MTT法检测半边莲总提取物、新山梗菜碱B和新山梗菜碱A2种生物碱分别在24、 48、72 h对Hela细胞的活性检测。可以看出半边莲醇提物及其单体生物碱均对Hela细胞生长具有抑制作用，相同给药浓度下半边莲醇提取物对Hela细胞生长的抑制效果不如半边莲单体生物碱对Hela细胞生长的抑制率，可以确定半边莲中的生物碱对Hela细胞癌症模型起抑制作用。