稀释涂布平板法计算公式的推导
——对一道一题多析计算题的透视

甘肃

1. 问题的提出

（节选）如图1为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是（ ）

图1

C. 5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个

【解析一】5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为（168+175+167）÷3×105×10=1.7×108个，C 错误。

【解析二】5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为（168+175+167）÷3×105×10÷10=1.7×107个，C错误。

这是某教辅资料中的一道应用稀释涂布平板法计数微生物数目的习题，关于C选项的解析存在两种不同的看法。对比分析，上述解析的分歧有两方面：一是5号试管的稀释倍数到底是多少倍？二是根据教材公式计算所得结果到底是每克土壤样品中的菌株数还是10 g样品中的菌株数？

2. 从梯度稀释过程判断稀释倍数

应用稀释涂布平板法统计样品中活菌数的关键是将样品进行一系列的梯度稀释，如何进行梯度稀释？

从人教版教材内容来看，这种稀释方法就是10倍稀释法，概括地讲：一般固体样品取10 g，液体样品取10 mL，以无菌操作法将其加入到装有90 mL无菌水的三角瓶中，充分振荡5～10 min，使微生物细胞分散，静置20～30 s，即成101倍稀释液；再用1 mL无菌吸管，吸取101倍稀释液1 mL移入9 mL无菌水的试管中，吹洗3次，让菌液混合均匀，即成102倍稀释液；再换一支无菌吸管吸取102倍稀释液1 mL移入9 mL无菌水的试管中，即成103倍稀释液；以此类推，一定要每次更换吸管，连续稀释，制成 104、105、106、107、108、109等一系列稀释度菌液，供平板接种使用。

从上述稀释过程可以看出：（1）固体样品的101倍稀释液是按照质量百分比浓度稀释，其他倍数稀释液是按照体积比浓度稀释，而液体样品的稀释都是按体积比浓度稀释；（2）低稀释倍数的稀释液体积与无菌水的体积相加即为高稀释倍数稀释液总体积；（3）样品无论是固体样品还是液体样品，10 g或10 mL样品加入90 mL无菌水中，即为将样品稀释101倍，将101倍稀释液的总体积看成100 mL。这样处理简单易行，操作方便。

由此可见，如果每次都是稀释10倍，稀释n次，则稀释倍数为10n；如果第一次稀释100倍，后续稀释都是10倍，共稀释n次，则稀释倍数为10n+1。故上述习题中，5号试管的稀释倍数为106倍。

3. 结合梯度稀释过程推导计算公式

结合上述习题中的稀释过程，分别取5号试管中的稀释液（即106倍稀释液）0.1 mL涂布三个平板，计数平均值为C，则10 mL的106倍稀释液中共有活菌数为（C÷0.1）×10。这些活菌来自1 mL的105倍稀释液（4号试管），则10 mL的105倍稀释液中共有活菌数为（C÷0.1）×102。依此类推，100 mL的101倍稀释液中共有活菌数为（C÷0.1）×107。10 g土壤样品全在100 mL的101倍稀释液中，所以每克土壤样品中的活菌数为（C÷0.1）×107÷10=（C÷0.1）×106。该算式中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，0.1为涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）（用V表示），106为稀释倍数（用M表示），即可得到稀释涂布平板法计算公式：（C÷V）×M。

由此可见，该公式计算结果为每克（或每毫升）样品中的菌株数。

上述习题106倍稀释液下平板上生长的平均菌落数C=（168+175+167）÷3=170，V=0.1，M=106，所以5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个，即解析一、二均存在理解误区。

4. 典型例题

【例1】（2018年，全国卷Ⅰ，第37题节选）（4）甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：

甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；

乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。

有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是：________________。

【解析】计数时一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。乙同学一个平板的计数结果与另两个相差悬殊，可信度低。

【答案】乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差

【例2】（2016年，四川卷，第10题节选）图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列（图乙略）。

（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。

该过程采取的接种方法是________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。

【解析】（2）平板上接种稀释倍数为105的土壤样品液，该接种方法为稀释涂布平板法；5个平板上的菌落数分别为13、156、462、178和191，选择菌落数为30～300的平板进行计数，0.1 mL稀释倍数为105的培养液含有产脲酶菌的数目为（156+178+191）÷3=175个，则每克土壤样品中的细菌数量为（175÷0.1）×105=1.75×108个；可能2个或多个产脲酶菌共同形成一个菌落，与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较少。

【答案】（2）稀释涂布平板法 1.75 少

【例3】（2014年，全国卷Ⅱ，第39题节选）为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：

（1）该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机选取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是______；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为______。

【解析】（1）为了确定培养基的灭菌是否合格，微生物学实验一般会随机选取若干灭菌后的空白平板培养一段时间，观察培养基上是否有菌落出现；根据题意，C=38，V=0.1，M=100，据此计算出每毫升水样中的活菌数是3.8×104，再乘以103即可得出每升水样中的活菌数是3.8×107。

【答案】（1）检测培养基平板灭菌是否合格3.8×107

5. 结语

在教学过程中，教师应结合人教版教材选修1《生物技术实践》第23页：图2-7样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图引导学生对稀释和取样培养过程进行分析，学会判断稀释倍数，自主总结出稀释涂布平板法计算公式。否则，直接将公式告知学生，会使学生不明所以，导致应用公式错误频出的情况。例2题目中的“每克土壤样品中的细菌数量为________×108个”就是对本文提到的两种解析的最好回应。当出现这种说法不一的情况时，教师要敢于引导学生质疑，培养学生的批判性思维。

另外，从近几年高考题对稀释涂布平板法的考查情况来看，涉及对照实验设计、结果分析、计数等，如上述例1和例3，其实这些设问方向都是围绕“使所得估计值更接近实际值”这一核心问题展开的。因此，进行实验操作和解答题目时应该注意：（1）严格按无菌操作进行实验；（2）随机选取若干灭菌后的平板先培养一段时间，检测平板灭菌是否彻底，如果出现菌落，说明灭菌不彻底，需要重新倒平板；或在空白平板上涂布等量的无菌水作为空白对照，以确定培养过程中是否存在杂菌污染现象。如果空白对照组的平板上出现菌落，说明存在杂菌污染现象，需要重新进行实验；（3）每个稀释倍数的菌液至少涂布3个平板，设置重复实验，计算平均值，以减小误差，提高可信度；（4）注意接种量（V）和培养时间，一般接种0.1 mL稀释液，接种量过多或时间过长会造成两个菌落连成一个；（5）选择菌落数在30～300之间的平板进行计算，计算时应该去掉偏离这个范围的数据。