基于肠道益生菌的中药防治疾病作用研究进展＊

赵 鑫，付志飞，高秀梅

（天津中医药大学中医药研究院方剂学教育部重点实验室 天津 301617）

哺乳动物的胃肠道内有大量不同数量的微生物群落，称为肠道菌群[1]。肠道益生菌是指肠道内的活的微生物，当补充足够数量时，有助于保护肠道及身体健康，表现为改善肠道菌群和肠内微环境，增强免疫功能，预防或治疗腹泻、便秘、腹胀气等肠道疾病，有助于营养吸收、调节因肠道菌群失调造成的代谢异常（骨代谢和糖脂代谢等）[2]。中医药对肠道菌群的调控研究已成为中医药研究的热点[3-7]。其中，中药在促进肠道益生菌尤其是双歧杆菌（Bifidobacterium）和乳杆菌（Lactobacillus）的生长、调节肠道菌群紊乱等方面作用显著[8,9]。此外，肠道益生菌对中药成分的代谢而产生具有药理活性的物质，也为开展中药代谢研究提供参考[7,10]。本文聚焦肠道益生菌，汇总其对中药防治疾病作用机制的研究，为中医药的肠道菌群作用靶点及机制研究提供理论依据，并结合现代医药发展前沿，为益生菌应用于中药的前景进行分析，为临床合理用药提供参考。

1 肠道益生菌在疾病防治中的重要性

1.1 肠道益生菌与骨质疏松

益生菌对骨质疏松的防治作用研究主要围绕益生菌对肠道菌群及免疫调节作用等方面展开，并取得了一定的成果[11]。益生菌通过生产抗菌活性物质抑制致病微生物的生长，来调节肠道菌群平衡，进而改善骨代谢[12,13]。如用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）喂养母鸡可提高其胫骨厚度，还可有效预防沙门氏菌（Salmonella）感染导致的骨量减少[14]。另外，益生菌对免疫具有一定的调节作用，通过刺激免疫细胞分泌细胞因子，提高机体细胞免疫力而防治骨质疏松[15]。对雌激素缺乏的去势小鼠进行罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）灌胃饲养后，与未进行益生菌干预组相比，骨标志物及免疫因子表达量明显提高，依此推测罗伊氏乳杆菌可能通过调节小鼠肠道菌群及免疫功能来改善骨代谢[11,16]。最新研究发现，鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）可使肠道中梭菌纲丰度上升，产生更多丁酸，进而使小鼠肠道和骨髓中调节性T 细胞增多，活化成骨细胞相关的信号通路，最终刺激骨生成[17]。也有研究表明益生元通过增加肠道益生菌含量，进而增加骨的矿化作用，增强骨密度，促进物质元素的吸收[18]。

1.2 肠道益生菌与肥胖、糖尿病

研究表明，高脂饮食可能会引起肠道菌群失调，进而导致肥胖和糖尿病等代谢性疾病。与肥胖相关的肠道菌群组成模式，通常用厚壁菌门/拟杆菌门的比值（Firmicutes/Bacteroidetes）来反映。与对照组相比，肥胖者的F/B的比值增大，肠道菌群多样性较低[19,20]。动物实验显示，乳杆菌或双歧杆菌给药后脂肪组织质量减少，且通过调节肝脏中的生脂和脂解基因的表达、降低肝脏脂肪变性、改善血脂和葡萄糖耐受性、降低内毒素血症以及调节炎症等途径来缓解肥胖[21]。临床研究表明，肥胖及代谢性疾病患者口服活菌制剂或益生元后体重降低，推测益生菌在肠道定植后参与到脂肪分解代谢过程而发挥降低体重功效[22]。此外，益生菌在防治糖尿病方面也有广阔前景。将多菌株益生菌给予2 型糖尿病患者后，表现为糖化血红蛋白和瘦素的水平降低，葡萄糖耐受性提高，保护胰腺免受损伤，且具有降低空腹和餐后血糖水平和改善胰岛素抵抗的有益作用[23]。临床实验研究显示，加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）可以有效减轻体重，而“高脂饮食”会减少小肠中的加氏乳杆菌，并破坏ACSL3-脂肪酸感受过程，从而影响血糖代谢平衡，这也是体重增加的一个原因，而补充加氏乳杆菌，可以发挥帮助糖尿病人进行血糖调控的作用[24]。

1.3 肠道益生菌与心血管疾病

肠道菌群失调不仅引起代谢性疾病，代谢紊乱还会引起包括高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病。研究表明，肠道菌群失衡促进高血压的发生，且用益生菌或其发酵产品干预后，可以调节肠道微生态，高血压状态也得以改善。用鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）干预小鼠后，其辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）细胞减少，可预防诱导型和盐敏感性高血压发生。同时临床研究发现，盐摄入量与TH17 细胞量和血压值成正比，而且肠道中多种乳杆菌属益生菌减少[25]。关于益生菌降压的机制，有产生肽类等降压物质或短链脂肪酸的作用，改善血管氧化和炎症水平等[26]。此外，益生菌的添加还能够改变肠道菌群的组成，从而影响动脉粥样硬化的发展。在实验研究中，通过对载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠注射噬酸乳杆菌（Lactobacilus acidophilus）ATCC4356，有效减少了氧化应激和炎症反应，进而抑制动脉粥样硬化的病变发展[27]。此外，乳杆菌、双歧杆菌等有益菌能降低胆固醇及有害物质氧化三甲胺（Trimetlylamine oxide，TMAO）的水平，继而降低心血管疾病的发生[28,29]。短链脂肪酸乙酸酯作为肠道益生菌的主要代谢产物之一，它的产生和分布可以解释膳食纤维在心血管疾病的发展中起到的有益作用，且醋酸盐影响并改善心血管健康和功能相关分子的变化[30,31]。

2 中药与肠道益生菌的相互作用

2.1 中药对肠道益生菌生长促进作用

中药复方或单味中药诸多研究发现，中药及复方具有促进肠道益生菌的生长、调节肠道菌群失调的作用。中药复方健脾渗湿汤，参苓白术散，四君子汤，理中汤在治疗脾虚时，小鼠肠道中乳杆菌和双歧杆菌含量显著提高；七味白术散，健脾益肠汤和补中益气汤通过扶植小鼠肠道益生菌生长而缓解肠道菌群失调；芪黄口服液在治疗肝硬化过程中，患者肠道菌群中乳杆菌和双歧杆菌也同样含量提高；葛根芩连汤也可使肥胖和糖尿病患者肠道中双歧杆菌含量增加[4]。此外，单味中药人参，黄连素，金银花，麻黄碱，熟地黄，艾叶和大黄素均对不同疾病模型的肠道菌群中乳杆菌等肠道益生菌具有增殖作用[3]。杨君以保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）为菌株，研究中草药对乳酸菌生长的影响，结果发现，这两种菌于生地黄、阿胶、绿茶茶叶和党参药液中生长良好[8]。杜仲水提物在适当浓度下可促进嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）的增殖及其胞内外蛋白的分泌[9,32]。

2.2 中药联合肠道益生菌对有害菌的抑制作用

迄今为止，国内外已对大量单味中药及中药单体进行了抗菌试验，证实多种中药具有直接抗菌作用，如黄连、金银花、大黄、夏枯草等对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有较好的抑制作用[33,34]。中药复方葛根芩连汤对金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae）和 痢 疾 杆 菌（Shigella dysenteriens）均有抑菌作用[35]。艾叶、苦参、花椒、苍耳子、苦谏皮和露蜂房6 味中药组成的复方对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌（Candida albicans）及大肠杆菌（Escherichia coli）具有较强的抑菌活性[36]。中药对有害菌的抑制的同时，间接增加了有益菌在肠道菌群中的丰度。此外，中药的抑菌作用也表现在通过促进益生菌的生长，在其与益生菌的联合作用下，抑制有害菌的生长而维持肠道微生态平衡[13]。研究证实，在适宜的临床剂量下，杜仲叶可通过促进益生菌保加利亚乳杆菌的生长来实现对致病菌金黄色葡萄球菌的抑制，优化肠道菌群结构，并发挥其补益作用[37]。

2.3 肠道益生菌对中药的代谢作用

中药大多采用口服方式进入消化道。在消化道内，难以吸收并且滞留时间较长的中药成分可能通过肠道菌群进行生物转化，因此开展肠道菌群对中药代谢作用的研究意义重大[38-40]。益生菌通过分泌酶类物质，提高中药药效成分的生物利用度而提高药效[41]。例如，益生菌分泌的糖苷酶可将苷类化合物转化成苷元，如芍药苷是芍药的主要活性成分，通过被肠道益生菌产生的β-葡萄糖苷酶和酯酶催化为芍药苷元，从而更好的发挥药效[10]。芍药苷与脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）或短乳杆菌（Lactobacillus brevis）共同培养后，产生了药物活性物质芍药苷元和芍药代谢素[42]。黄酮类化合物葛根黄素通过粪肠球菌（Enterococcus faecalis）和双歧杆菌的代谢作用得到大豆苷元[43]。生物碱类化合物乌头碱通过脆弱拟杆菌和丁酸梭菌（Clostridium butyricum）代谢后，得到毒性较弱的脂乌头碱[44]。因此，开展肠道益生菌对中药中有效成分的生物转化研究是提升中药药效的重要途径之一，探索其菌转化机制不仅为中药的肠道菌群靶点研究提供理论基础，也为中药药理研究提供指导意义。

3 中药与肠道益生菌相互作用研究方法

3.1 高通量测序法

高通量基因测序技术的发展以及强大的生物信息学分析工具的开发，为研究中药与肠道菌群的相互作用提供了新的思路。该方法通过对样品中所有微生物的DNA 进行整体提取、测序，在很大程度上为环境中不可培养微生物和痕量菌的研究提供了新的思路[45,46]。相比于传统焦磷酸测试技术，Illumina测序技术具有通量更高、错误率更低、成本更低等优势，从而成为宏基因组测序市场的主流。大多数研究通过高通量测序技术对人或小鼠粪便菌群进行整体多样性分析，得出中药作用的靶点菌群（菌）。临床应用上，采用高通量测序技术研究葛根芩连汤治疗2型糖尿病湿热证的疗效及对患者肠道菌群的影响，结果显示葛根芩连汤联合西药可有效治疗湿热证2型糖尿病，拟杆菌（Bacteroides）和梭杆菌（Fusobacterium）含量变化可作为疗效观察的标志物[47]。也有研究采用高通量测序结合药理学及药代动力学分析，对中药的肠道菌群药理及代谢机制进行研究。文献[5]中研究了中药复方中的多糖成分对模型小鼠肠道菌群和内源性代谢物的影响，以及该条件下的菌群对人参皂苷的作用[48]。

3.2 实时荧光定量PCR法

实时荧光定量PCR 技术是一种在PCR 反应体系中加入荧光标记物，依托模板扩增产物的量与荧光强弱程度的正比关系，对荧光信号进行实时计量而对目的基因进行定量分析的方法[46]。该技术主要针对样品中某些特定菌种进行定量研究，如益生菌。有文献报道，实时荧光定量PCR方法用于检测双歧杆菌等益生菌对小鼠肠道菌群的改善作用[49]。应用实时荧光定量PCR法对灌胃不同配伍比例的附子和红参的大鼠粪便中的总菌、乳杆菌和拟杆菌的相对含量进行检测分析，当附子和红参的配伍比例为1∶2 时，能在一定程度上改善肠道的微生态环境，促进有益菌的生长[50]。荧光定量PCR法往往与高通量测序相结合，对高通量测序结果进行验证。研究甜樱桃对肥胖小鼠肠道菌群影响时发现，乳杆菌和肠杆菌丰度的16S 测序结果与PCR验证结果一致[51]。

3.3 肠道益生菌的传统分离、培养法

肠道益生菌的筛选分离主要根据中药与肠道菌群的相关性分析基础上，通过最佳培养基的使用，联合微生物生理生化及分子生物学方法对肠道益生菌进行分离、鉴定。其中，抗菌活性被认为是益生菌竞争性地捧除或抑制肠道中有害致病微生物的一个重要的手段。益生菌产生抗菌化台物包括有机酸或具有杀菌或抗菌活性的肽和蛋白[52,53]。因此抑菌活性是对肠道益生菌筛选的必要条件。由于许多物质具有相对窄的抑菌谱，筛选期间抗菌活性检测具有十分重要的作用，指示菌的挑选十分关键。随后，将中药与肠道益生菌共培养，绘制生长曲线。对具有抑菌活性的中药测定最小抑菌浓度，对具有促进生长作用的中药测定最适生长浓度，并进一步研究相互作用机制。结合高通量测序，采用传统微生物实验法从泰国志愿者肠道中分离鉴定出的益生菌芽孢杆菌后，对其抑制病原菌金黄色葡萄球菌的肠道定植的分子机制进行了研究[54]。还有研究者从健康猪肠道食糜中筛选到l 株能抑制大肠埃希菌、副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌和巴氏杆菌生长的芽孢杆菌AP139，其与中草药五倍子具有协同抑菌作用[55]。

3.4 粪菌移植法

粪菌移植是一种将健康供体粪便中的功能菌群移植到疾病受体胃肠道内，重建具有正常功能肠道菌群的技术，以此来实现对肠道内、外疾病的治疗[56]。目前报道粪菌移植已应用于临床艰难梭菌感染、炎症性肠病、肠易激综合征、代谢综合征等多种疾病的治疗中[57]。基于高通量测序以及关联代谢谱分析结果，确定中药作用的功能菌群，即靶点肠道益生菌，通过特定培养条件对目的菌株进行体外分离、纯化和鉴定。将分离得到的目的菌株进行体外培养或将服用中药的动物粪便，通过灌胃到动物肠道内，从而达到粪菌移植的目的，改善肠道菌群。抗生素的使用破坏了小鼠肠道微生态的动态平衡，且降低了小鼠肠道菌群的多样性，而复合菌（双歧杆菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌）液对小鼠肠道菌群的恢复具有明显的作用[58]。益生菌灌胃治疗疾病小鼠也已应用到骨质疏松、糖尿病、肥胖、心血管疾病研究中[17,24,25]。同时，粪菌移植也是中医药基于肠道菌群的靶点机制研究的重要验证手段。通过研究旱莲草对骨质疏松小鼠肠道菌群影响，将高通量测序得到的靶点益生菌乳杆菌和乳球菌进行体外培养后灌胃到骨质疏松小鼠中，小鼠的骨质疏松和肠道菌群均得到了改善，为旱莲草通过肠道菌群防治骨质疏松的作用机制研究提供理论依据[59]。此外，为找到灵芝水提物通过肠道菌群缓解肥胖的证据，将喂养灵芝水提物的小鼠粪便移植给高脂饮食小鼠，结果发现与直接喂食灵芝水提物效果相似[6]。

4 展望

近年来，蛋白质组学、转录组学、宏基因组学及代谢组学等“组学”技术蓬勃发展。该类“组学”技术对中药经肠道作用过程中涉及的靶点菌的挖掘、筛选和鉴定具有重要意义。益生菌是肠道菌群的重要组成部分，对肠道微生态平衡具有调节作用，中药可以通过促进益生菌的生长来发挥药效作用；同时，中药经肠道内益生菌生物转化，其有效成分的生物利用度和药效可以得到提高，两者相辅相成。开展中药基于肠道益生菌的疾病防治作用研究，有利于辅助佐证中药复方配伍的合理性和科学内涵，进而为中药联合肠道益生菌新药的研制开发提供理论指导和应用前景。