液基细胞学涂片法检测痰抗酸杆菌对肺结核的诊断价值

李明瑛，姚恒波，柴青峰，席秀娥，王 霞，牛文一

(1.新乡医学院第一附属医院结核内科四病区，河南 卫辉 453100；2.新乡医学院第一附属医院结核病研究所，河南 卫辉 453100)

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种传染病，也是单一致病菌感染导致病死率最高的疾病，我国是全球22个结核病高负担国家之一，发病率仅次于印度及印度尼西亚[1]。结核病可以累及多个器官，包括肺、骨、肾等，其中肺结核最常见且最具有传染性。早期诊断对肺结核的防控和治疗至关重要[2]。目前，细菌学检测仍是肺结核诊断的金标准，常用的检查方法为直接痰涂片镜检法(简称“直接涂片法”)和罗氏培养法。直接涂片法操作简单，成本低，但阳性率低；罗氏培养法阳性率高，但培养周期需要4～8周[3]；这2种方法均不能完全满足临床诊治的需要。液基细胞学涂片法抗酸杆菌检测技术(简称“液基细胞学涂片法”)是通过特殊的痰保存液液化痰液，采用离心方法收集细菌的过程，提高痰抗酸杆菌的检出率，并结合液基细胞学技术，达到痰涂片的标准化。本研究应用直接涂片法、罗氏培养法和液基细胞学涂片法检测同一痰液标本中的抗酸杆菌，探讨液基细胞学涂片法检测痰抗酸杆菌对肺结核的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料选择新乡医学院第一附属医院结核内科2017年6～8月收治的251例肺结核患者作为研究对象，其中男141例，女110例，年龄18～72(47.0±18.4)岁。本研究经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。入选病例均符肺结核诊断标准[4]。

1.2主要试剂与仪器抗酸菌染色液(珠海贝索生物技术有限公司)，标本保存液(宜兴市润迪医疗器械有限公司)；抗酸杆菌药敏罗氏培养管(珠海贝索生物技术有限公司)，KP-1型快速干片机(常州派斯杰公司)，调速多用振荡器HY-4(常州国华电器有限公司)，薄层液基细胞制片机(长沙湘智离心机仪器有限公司)，数显三用恒温水箱(常州国宇仪器制造有限公司)。

1.3检测方法留取患者夜间痰、晨痰、即时痰各1份，每份5.0～8.0 mL。对每份痰液标本同时进行直接涂片法、液基细胞学涂片法和罗氏培养法进行检测。直接涂片法按照《中国结核病防治规划—痰涂片镜检质量保证手册》[4]进行操作；液基细胞学涂片法是将已采样的痰液保存瓶瓶盖拧紧静置 5 min 后震荡3 min进行液化，70 ℃水浴恒温箱中加热15 min，4 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，提取10～20 μL浓缩样本加入制片夹中并加入 1 mL 蒸馏水，1 min制片即可完成，最后烘干玻片，苯酚染色2 min，水洗，盐酸乙醇分化至无红色染料脱落水洗，亚甲基蓝染色30 s，水洗，上镜观察。罗氏培养法按照《结核病诊断细菌学检验规程》[6]进行操作。

1.4液基细胞学涂片法安全性试验取直接涂片法及液基细胞学涂片法均为3+或4+的痰液标本12份，每份约2 mL，其中6份加入1倍的样本保存液处理5～15 min后，3份加热，3份不加热，均进行罗氏培养，另外6份加入2倍的样本保存液，处理时间及方法同上，观察抗酸杆菌的生长情况。

1.5质量控制直接涂片法质量控制按照《中国结核病防治规划—痰涂片镜检质量保证手册》[5]进行，液基细胞学涂片法及罗氏培养法均按照《结核病诊断细菌学检验规程》[6]进行。

1.6统计学处理应用SPSS 17.0软件进行数据分析，计数资料以百分率表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.13种方法对不同时间痰液中抗酸杆菌的阳性检出率比较结果见表1。直接涂片法、液基细胞学涂片法和罗氏培养法对夜间痰抗酸杆菌的阳性检出率分别为12.35%(31/251)、22.31%(56/251)、23.90%(60/251)，对晨痰抗酸杆菌的阳性检出率分别为21.51%(54/251)、30.28%(76/251)、32.27%(81/251)，对即时痰抗酸杆菌的阳性检出率分别为7.97%(20/251)、13.94%(35/251)、15.94%(40/251)。直接涂片法、液基细胞学涂片法和罗氏培养法对晨痰抗酸杆菌的阳性检出率高于夜间痰和即时痰，差异有统计学意义(χ2=7.492、18.323、4.111、19.443、4.349、18.305，P<0.05)。液基细胞学涂片法、罗氏培养法检测夜间痰、晨痰、即时痰抗酸杆菌的阳性检出率高于直接涂片法(χ2=8.690、5.024、4.594、11.288、7.386、7.571，P<0.05)；液基细胞学涂片法检测夜间痰、晨痰、即时痰抗酸杆菌的阳性检出率与罗氏培养法比较差异无统计学意义(χ2=0.179、0.232、0.392，P>0.05)。

表13种方法检测不同时间痰抗酸杆菌的阳性检出率比较

Tab.1Comparisonofpositivedetectionratesofacid-fastbacillusatdifferenttimedetectedbythreemethods

n直接涂片法阳性/例(%)阴性/例(%)液基细胞学涂片法阳性/例(%)阴性/例(%)罗氏培养法阳性/例(%)阴性/例(%)χ2P夜间痰25131(12.35)a220(87.65)56(22.31)ab195(77.69)60(23.90)ab191(76.10)12.527<0.05晨痰25154(21.51)197(78.49)76(30.28)b175(69.72)81(32.27)b170(67.73)8.151<0.05即时痰25120(7.97)a231(92.03)35(13.94)ab216(86.06)40(15.94)ab211(84.06)7.829<0.05χ221.83719.578-56.475P<0.05<0.05<0.05

注：与晨痰比较aP<0.05；与直接涂片法比较bP<0.05。

2.23种方法对不同性质痰液中抗酸杆菌的阳性检出率比较结果见表2。在753份痰液标本中，脓性痰301份，血痰48份，黏液痰334份，唾液痰70份。直接涂片法对脓性痰、血痰、黏液痰、唾液痰抗酸杆菌阳性检出率分别为36.21%(109/301)、41.67%(20/48)、8.08%(27/334)、2.86%(2/70)；液基细胞学涂片法对脓性痰、血痰、黏液痰、唾液痰抗酸杆菌的阳性检出率分别为48.84%(147/301)、64.58%(31/48)、11.98%(40/334)、14.29%(10/70)；罗氏培养法对脓性痰、血痰、黏液痰、唾液痰抗酸杆菌的阳性检出率分别为50.17%(151/301)、62.50%(30/48)、15.27%(51/334)、15.71%(11/70)。直接涂片法、液基细胞学涂片法和罗氏培养法对血痰抗酸杆菌的阳性检出率高于脓性痰、黏液痰、唾液痰，差异有统计学意义(χ2=4.102、43.867、28.275、4.107、76.758、31.772、4.214、56.033、27.490，P<0.05)。液基细胞学涂片法、罗氏培养法检测脓性痰、血痰、黏液痰、唾液痰抗酸杆菌的阳性检出率高于直接涂片法(χ2=9.814、11.943、5.061、4.174、4.103、8.361、26.054、23.941，P<0.05)；液基细胞学涂片法检测脓性痰、血痰、黏液痰、唾液痰抗酸杆菌的阳性检出率与罗氏培养法比较差异无统计学意义(χ2=0.106、0.045、1.539、0.056，P>0.05)。

表23种方法检测不同性质痰抗酸杆菌的阳性检出率比较

Tab.2Comparisonofthepositivedetectionratesofacid-fastbacilluswithdifferentpropertiesdetectedbythreemethods

n直接涂片法阳性/例(%)阴性/例(%)液基细胞学涂片法阳性/例(%)阴性/例(%)罗氏培养法阳性/例(%)阴性/例(%)χ2P脓性痰301109(36.21)a192(63.79)147(48.84)ab154(51.16)151(50.17)ab150(49.83)14.421<0.05血痰4820(41.67)28(58.33)31(64.58)17(35.42)30(62.50)18(37.50)6.265<0.05黏液痰33427(8.08)a307(91.92)40(11.98)ab294(88.02)51(15.27)ab283(84.73)8.319<0.05唾液痰702(2.86)a68(97.14)10(14.29)ab60(85.71)11(15.71)ab59(84.29)7.129<0.05χ2101.883137.345117.119P<0.05<0.05<0.05

注：与血痰比较aP<0.05；与直接涂片法比较bP<0.05。

2.33种方法检测痰抗酸杆菌的灵敏度、特异度比较以罗氏培养法作为金标准，直接涂片法检测痰抗酸杆菌的灵敏度和特异度分别为40.33%、94.41%，液基细胞学涂片法检测痰抗酸杆菌的灵敏度和特异度分别为70.72%、93.18%；液基细胞学涂片法检测痰抗酸杆菌的灵敏度高于直接涂片法，差异有统计学意义(χ2=33.507，P<0.05)；液基细胞学涂片法与直接涂片法检测痰抗酸杆菌的特异度比较无统计学意义(χ2=0.237，P>0.05)。

2.4液基细胞学涂片法安全性试验结果在标本中加入1倍或2倍痰保存液后，分别放置5、10、15 min，无论是否加热，接种于罗氏培养基上培养8周，均未见抗酸杆菌生长。

3 讨论

我国每年有约80万的新发结核病患者，活动性肺结核患者高达500万人[7]。目前，结核病防控面临的主要问题是缺乏及时有效可靠的诊断，导致结核病不能及时治疗。一些主流的结核病诊断方法均存在一定的局限性，结核菌素皮肤实验由于结核杆菌的高感染率和卡介苗的使用导致其临床应用价值不高，影像学资料因临床医生主观意识较强常无法达到一致，内镜结合病理学检查具有侵入性，且不易操作，因此，痰涂片抗酸杆菌镜检仍是我国开展结核病控制项目时最符合成本效益原则的细菌学试验技术[2]，它具有简单、快速、易行、可靠的特点，但敏感性不高，当每毫升痰液中抗酸杆菌浓度达到 5 000～10 000 条时，结果才呈阳性。液基细胞学涂片法将标本全部保存于液基保存液中，最大限度地提取痰液进行制片，细菌采集量大大增加，并通过离心、甩片等过程，将细胞和细菌单层均匀地分布在玻片上，无重叠挤压或物理损伤变形，形态和内部结构保持良好，涂片中也除去了血液和黏液的成分，背景清晰干净，细胞形态保持良好，易于观察诊断[8]；液基细胞学涂片法的显著特点是对痰标本的利用率高，符合不丢弃任何所取材料的原则[9]，对保存在液基瓶内的细胞可以制作多张涂片，对同一标本也可以进行多项检查，如免疫细胞化学检查及基因检测等，同时，液基细胞染色技术使痰涂片达到标准化，降低了因在涂片和染色过程中不按程序规范操作导致的结果差异[10]。

研究显示，直接涂片法检测晨痰，其抗酸杆菌阳性率约20%[11-12]，而罗氏培养法对临床结核病患者晨痰中抗酸杆菌的阳性检出率约为30%[13-14]，这与本研究结果一致。本研究结果显示，液基细胞学涂片法检测痰抗酸杆菌的阳性检出率明显高于直接涂片法；液基细胞学涂片法检测痰抗酸杆菌的阳性检出率略低于罗氏培养法，但差异无统计学意义。以罗氏培养法作为检测痰抗酸杆菌的金标准，液基细胞学涂片法检测痰抗酸杆菌的灵敏度和特异度分别为70.72%、93.18%，直接涂片法的灵敏度和特异度分别为40.33%、94.41%，液基细胞学涂片法检测痰抗酸杆菌的灵敏度高于直接涂片法，特异度相仿。

影响痰抗酸杆菌检测的主要因素有标本性质、操作人员操作不规范等，而液基细胞学涂片法可以有效减少操作人员的操作误差，实现涂片的标准化。在对痰标本性质的影响中，本研究主要讨论了留痰时间和痰液性质，结果显示，3种检测方法对晨痰中抗酸杆菌的阳性检出率最高。故在临床工作中，建议送检晨痰，有利于提高痰抗酸杆菌的阳性检出率。且本研究结果显示，3种检测方法对血痰中抗酸杆菌的阳性检出率最高，这可能与结核病情活动性较强，且血痰多来自病灶的空洞内有关。

本研究还进行了液基细胞学涂片法安全性试验，12份痰液标本经不同比例的标本保存液处理 5～15 min后，无论是否加热，罗氏培养法检测结果显示均未见抗酸杆菌生长，提示液基细胞学涂片法的生物安全性高，相比直接涂片法对实验室工作人员的安全更有保障。

综上所述，液基细胞学涂片法检测痰抗酸杆菌操作简便易行，成本低廉，人为因素影响少，易标准化，阳性检出率高，有很好的生物安全性，可以弥补直接痰涂片镜检法的不足，提高了对肺结核临床诊断的指导意义，为患者尽早进行正规抗结核治疗赢得了宝贵时间。