四味余甘子方对高脂血症大鼠FFA、CETP及ABCA1影响的实验研究＊

周盼盼，杨如意

（1.青海大学医学院 西宁 810000；2.青海大学附属医院 西宁 810000）

随着社会生活水平的提高，高脂血症已逐渐成为临床常见的慢性疾病，发病率较前也已显著上升，同时发病人群年龄较前明显下降。《中国居民营养与慢性病状况报告（2015年）》显示，2012 年我国18岁以上成人血脂异常即高脂血症的患病率为40.4%，其TC、TG 水平较2002年明显增高[1]。高脂血症是诱发心脏血管病的危险因素,尤其是当以LDL-C 或TC 升高为主时，是动脉粥样硬化型心血管疾病的重要危险因素[2]。此外，大量研究开始提出高脂血症和骨质疏松[3]、慢性肾病[4]等疾病进展之间的关联，也有报道提示高脂血症在糖尿病与牙周炎双向关系中起着重要作用[5]。故积极防治高脂血症有着极其重要的临床意义。

本研究在中藏医传统理论指导下，在临床应用经验的基础上，将余甘子（Phyllanthus emblica Linn.）、诃子（Terminalia chebula Retz.）、毛诃子Terminalia billerica(Gaertn.)Roxb.、藏茵陈（Tibetan capillaris）组方为四味余甘子方。旨在进一步明确四味余甘子方对高脂血症模型大鼠血脂、血清ATP 结合盒转运蛋白A1（ATPbinding cassette transporter A1，ABCA1）、胆固醇酯转运蛋白（Cholesteryl ester transfer protein，CETP）、血清游离脂肪酸（Free fatty acid，FFA）及肝脏组织ABCA1 表达的影响，并试探讨其可能的作用机制，以期对临床防治高脂血症有所裨益。

1 材料

1.1 动物

SPF 级SD 雄性大鼠60 只，体质量200 g±20 g，由甘肃中医药大学提供，许可证号：SYXK（甘）2015-0005。

1.2 药物与试剂

四味余甘子方由余甘子、诃子、毛诃子、藏茵陈按一定比例组成。本实验所用余甘子提取物（批号：ZL2017061201）、藏茵陈提取物（批号：ZL2017082106）、诃子提取物（批号：ZL2017082201）、毛诃子提取物（批号：ZL2017082202），均由南京泽朗生物科技有限公司提供4°C贮存备用。血脂康胶囊由北大维信生物科技有限公司生产（批号：20161110）。

脂肪乳剂配方：胆固醇2%、食用猪油10%、蛋黄粉5%、吐温-80 0.2%、丙硫氧嘧啶1%，自制；胆固醇（批准文号：复合津Q/HG3-1288-99）由天津原四通化工厂生产；蛋黄粉由江苏祥晟生物科技有限公司提供；吐温80（批号：20170323A）由河南亚统食品原料有限公司提供；丙基硫氧嘧啶由武汉胜天宇生物科技有限公司提供。

TC、TG、LDL-C、HDL-C、ABCA1、CETP、FFA 还原酶试剂盒均由上海远慕公司提供，批号均为2018012。免疫组化试剂：ABCA1：Santa Cruz 公司产品,货号：sc-58219；鼠二抗：北京中杉金桥，货号：sp-9002；显色剂：DAB：北京中杉产品，货号：ZLI-9032。

1.3 仪器

全自动血液生化分析仪：日本AU640-OlymPus。显微镜：日本奥林巴斯BX51T-PHD-J11。CMOS：日本奥林巴斯。多功能真彩色细胞图象分析管理系统：美国Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus 6.0。

2 方法

2.1 药物及脂肪乳剂的制备

实验时四味余甘子方以及血脂康用蒸馏水溶解，配制成相应浓度水剂备用。配制脂肪乳剂时先将定量猪油隔水融化，边搅拌边加入一定比例的胆固醇、蛋黄粉、丙基硫氧嘧啶，加入吐温-80 乳化，最后以蒸馏水定容[6]备用。

2.2 分组、造模及给药

60 只SD 大鼠按体重以随机数字表法随机分为6组，正常对照组、模型对照组、阳性药物（血脂康）组、四味余甘子方低剂量组（以下简称为低剂量组）、四味余甘子方中剂量组（以下简称为中剂量组）、四味余甘子方高剂量组（以下简称为高剂量组）。大鼠适应性喂养1周后，除正常对照组继续喂普通饲料外，其余各组均在喂普通饲料基础上加以脂肪乳剂灌胃造模，剂量以1 mL·(100 g·d)-1计，正常对照组以等量生理盐水灌胃。造模同时，血脂康组、低剂量组、中剂量及高剂量组每天分别以0.11 g·kg-1、5.4 g·kg-1、10.8 g·kg-1、16.2 g·kg-1相应药物剂量灌胃，灌胃剂量以1 mL·(100 g·d)-1计，正常对照组及模型组每天以等量生理盐水灌胃，共4周。

2.3 检测指标及方法

2.3.1 检测血脂相关指标及血清CETP、FFA

于最后一次给药后，禁食禁水12 h后，以戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，静置，离心（3000 r，10 min），取血清，测定TC、TG、HDL-C、LDL-C、ABCA1、CETP、FFA含量。严格按ELISA检测试剂盒说明进行操作。

2.3.2 检测肝脏ABCA1

腹主动脉采血后，取出肝脏，取小于0.5 cm ×0.5 cm×0.1 cm组织块，用4%多聚甲醛进行固定，石蜡包埋，切片，脱蜡、入水，用免疫组化法测定ABCA1。

2.4 统计学方法

采用简明统计分析CS14.0统计软件进行处理，数据用均数±标准差（±S）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两组均数比较，方差齐时用t检验，方差不齐时用秩和检验。P＜0.05有统计学意义。

3 结果

3.1 对高脂血症模型大鼠血脂的影响

与正常对照组比较，模型对照组TC、TG、LDL-C含量明显升高，HDL-C含量明显下降（P＜0.05）；与模型对照组比较，各给药组TC、TG、LDL-C 均有所下降，LDL-C 有所升高（P＜0.05）；与血脂康组比较，低剂量组对血脂的调节作用较弱（P＜0.05）；中剂量组对TC、LDL-C的调节作用略优于血脂康组，但其对TG、HDLC的调节作用弱于血脂康组（P＜0.05）；而高剂量组对血脂的调节作用要优于血脂康组（P＜0.05）（表1）。

表1 各组血脂比较（n=10,±S）

表1 各组血脂比较（n=10,±S）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05；与血脂康组比较，ΔP＜0.05。

3.2 对高脂血症模型大鼠血清ABCA1、CETP、FFA的影响

与正常对照组比较，模型对照组ABCA1明显降低（P＜0.05），CETP、FFA 均明显升高（P＜0.01）；与模型对照组比较，血脂康组、低剂量组、中剂量组及高剂量组血清ABCA1均有所增加（P＜0.05），CETP、FFA均明显下降（P＜0.01）；与血脂康组比较，低、中、高剂量组CETP、FFA 均有不同程度下降（P＜0.01），低剂量组ABCA1低于血脂康组（P＜0.05），而中剂量组、高剂量组ABCA1 均有不同程度增加（P＜0.01）；以高剂量组对ABCA1、CETP、FFA 的干预作用较显著（P＜0.05，P＜0.01）（表2）。

表2 各组血清ABCA1、CETP、FFA的比较（n=10,±S）

表2 各组血清ABCA1、CETP、FFA的比较（n=10,±S）

注：与正常对照组比较，1*P＜0.05，*P＜0.01；与模型对照组比较，1#P＜0.05，#P＜0.01；与血脂康组比较，1ΔP＜0.05，P＜0.01。

3.3 对高脂血症模型大鼠肝脏组织ABCA1 表达的影响

光镜下可见，ABCA1 在大鼠肝细胞胞浆中表达，呈黄棕色。正常对照组表达广泛，黄棕色颗粒密布，染色较深；模型对照组呈散在表达，染色较浅。经药物干预后，各用药组大鼠肝组织中呈黄染颗粒的阳性细胞较模型对照组明显增多，染色均有不同程度加深，低、中、高剂量组黄染颗粒高于血脂康组（图1）。

图1 各组大鼠肝脏组织免疫组化ABCA1

免疫组化分析结果显示，模型对照组大鼠肝组织中ABCA1蛋白表达量比正常对照组明显降低，经药物干预后，与模型对照组相比，各给药组均能显著升高肝组织中ABCA1的蛋白表达量（P＜0.05），其中，高、中、低剂量组均高于血脂康组，以高剂量组最为明显（表3）。

表3 四味余甘子方对高脂血症模型大鼠肝脏组织ABCA1表达的影响

4 讨论

目前临床治疗高脂血症的药物主要为HGM-CoA还原酶抑制剂（他汀类）、苯氧芳酸类（贝特类）、烟酸类、胆酸螯合剂（树脂类）、肠道胆固醇吸收抑制剂、普罗布考及n-3脂肪酸制剂。最常使用的是他汀类和贝特类，临床降脂治疗多首选他汀类。他汀类药物可以诱导LDL-C下降，从而降低心血管疾病发病率和死亡率，主要用于治疗原发性、继发性高胆固醇血症，目前他汀类药物已成为高脂血症治疗的基石。但在临床实践中，许多患者使用他汀类药物治疗其血脂水平仍不能达标。2012 年血脂异常国际研究——中国住院患者他汀类药物治疗率88.9%，接受治疗患者中，38.5%未达低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）目标值[7]，LDL-C相关的残留风险仍然存在。而他汀类药物的副作用有消化道反应、肝毒性、肌病、血糖升高及神经毒性等，肌病为其常见的严重不良反应，严重时可发生横纹肌溶解，他汀类药物导致血小板减少的案例近年也屡有报道[8-10]。其他降脂药亦有不良反应，如贝特类药物的不良反应主要为消化道症状、胆石症、肝功损害等，与他汀类药物联用可发生肌病[11,12]。

由于以他汀类为代表的降脂药并不能使高脂血症患者的血脂均达到理想的水平，且有一定的副作用，因此，筛选具有调脂作用的中藏药制剂，充分发挥祖国传统医学防治高脂血症的优势是当前国内中医界共同关注的重点。目前已有大量试验证明中药单独或联用降脂药治疗高脂血症能取得不错甚至优于单用降脂药的临床效果[13-16]。故积极研究中藏药对高脂血症的作用并进一步探讨其作用机制，对临床防治高脂血症有着很重要的意义。

通过对高脂血症的深入研究，在中藏医传统理论指导下，课题组根据临床应用经验选用四味余甘子方治疗高脂血症。四味余甘子方由余甘子、诃子、毛诃子、藏茵陈组方而成。《中华人民共和国药典》将余甘子作为藏族习用药材收录，藏医药经典著作《晶珠本草》记载余甘子被用来治疗培根病、赤巴病及血病，其中血病就包括高血脂。现代药理研究也表明，余甘子、诃子、毛诃子有一定的调脂作用[17,18]，已有研究提出毛诃子、藏茵陈具有一定的肝脏保护作用[19,20]。

本次研究结果表明，四味余甘子方对高脂血症模型大鼠的血脂有调节作用，且以高剂量组作用最为显著。同时通过对各组血清CETP、FFA 的检测，最终表明各给药组CETP、FFA 均有不同程度降低，且以高剂量组降低最为明显,疗效优于血脂康组。

CETP 是一种血浆糖蛋白，在调节HDL-C 和胆固醇逆向转运中发挥重要作用，能介导胆固醇酯与甘油三酯在HDL、VLDL和LDL之间进行转运，以调节脂代谢。有大量研究证实使用CETP 抑制剂，在降低LDLC和升高HDL-C 两个方面均有效果，可以在一定程度上改善高脂血症[21-24]。本研究结果显示，四味余甘子方可降低高脂血症模型大鼠CETP，该方对血脂的调节作用或与其抑制CETP有关。

FFA 是一种由脂肪组织内TG 水解释放的非酯化脂肪酸，可作为许多器官的直接能量来源，并可由肝脏转化为酮体，对脂质代谢有一定影响。已有研究提出FFA 可以上调3-巯基丙酮酸硫转移酶（MPST），MPST可通过抑制CSE/H2S（胱硫醚γ-裂解酶/硫化氢）和随后上调的固醇调节元件结合蛋白1c通路（SREBP-1）、c-Jun 氨基末端激酶磷酸化（JNK）和肝脏氧化应激途径促进脂肪变性，导致脂肪肝[25]。本研究结果显示，四味余甘子方可降低血清FFA，调节脂质代谢，效果优于血脂康组，高剂量组效果较好。

本研究通过检测各组大鼠血清ABCA1 以及肝脏组织ABCA1，以期明确四味余甘子方对ABCA1表达的影响，最终得出结论：四味余甘子方能增加ABCA1 的表达，以高剂量组最为明显，且优于血脂康组，其对血脂的调节作用或与其增强ABCA1表达相关。

ABCA1 是由12 个跨膜结构域和两个ATP 结合盒（ABC）结构域组成的包括2261 个氨基酸的整合膜蛋白，主要分布在巨噬细胞和肝脏细胞，是胆固醇和磷脂从细胞流出到高密度脂蛋白（HDL）颗粒的关键调节因子[26,27]，ABCA1 可以介导细胞游离胆固醇和磷脂流向细胞外受体载脂蛋白AI（apoAI），以形成新的HDL[28]。有研究提出ABCA1 介导的HDL 形成过程在早期动脉粥样硬化病变发展中起着至关重要的作用，当ABCA1表达下调时会促进动脉粥样硬化的发展[29,30]。

ABCA1受肝X受体（LXRs）、过氧化物酶体增殖因子活化受体（PPARs）和视黄酸X受体（RXRs）的调控[31]，LXRs 和PPARs 是与RXRs 形成专性异二聚体的核受体成员，LXRs 与RXRs 的协同作用可以调节肝细胞和巨噬细胞中参与脂质代谢基因的表达，LXRs在高细胞固醇负荷条件下被激活，并诱导胆固醇外排转运蛋白ABCA1和ABCG1（ATP-结合盒转运蛋白G1）的表达以促进过量细胞胆固醇的外排[32]。PPARs 分为PPARα、PPARβ、PPARγ三型，PPARα激活后通过减少肝脏中的LXR/RXR异二聚化可以抑制LXRs信号传导。还有研究提出前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型（PCSK9）可以通过下调ABCA1基因和ABCA1蛋白表达对ABCA介导的胆固醇流出起直接抑制作用[33]。

综上，四味余甘子对高脂血症模型大鼠的血脂有较明显的调节作用，能显著降低血清CETP 及FFA 水平，增强ABCA1 的表达。其更深入的作用机制，以及可能存在的其它作用途径，亟待进一步研究。