加减补阳还五汤对膜性肾病大鼠TGF-β1、VEGF和MMP-9表达的影响*

刘张红 程锦国 陈玲玲 黄蔚霞# 项方家 张 良

1 浙江中医药大学附属温州中医院 浙江 温州 325000

2 温州市中西医结合医院 浙江 温州 325000

3 台州市中医院 浙江 台州 318000

近年来，我国膜性肾病（MN）患病率不断升高，2004年至2014年间MN发病率平均每年增加13%，并随着PM2.5的增加而增加，PM2.5每增加10μg/m3,MN发病率增加14%[1]。特发性膜性肾病（IMN）是构成中老年患者原发性肾病综合症的常见疾病，目前其发病机制尚未完全阐明，但主流的观点认为[2]，IMN中足细胞形态及功能的改变，是引起IMN大量蛋白尿的主要原因。目前，对于IMN的治疗以控制蛋白尿为主，ACEI和ARB能够减少膜性肾病患者尿蛋白漏出，是膜性肾病治疗的常用药，但其在临床使用中存在局限性。由于中医药在治疗IMN方面疗效确切，毒副作用较小而有着巨大的优势[3-5]。加减补阳还五汤是经我们长期临床应用后总结的经验方，其减少IMN的患者尿蛋白的功效确切[6]。本研究以膜性肾病大鼠为对象，观察加减补阳还五汤对大鼠血浆白蛋白、24h尿蛋白、肾脏组织病理形体和对转化生长因子-β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响，进一步对加减补阳还五汤治疗IMN的作用机制加以阐述。

1 材料和方法

1.1 实验动物造模及分组：SPF级雄性SD大鼠60只，体质量200±20g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2012-0002]。动物饲养于温州医科大学动物实验中心。大鼠实验性喂养1周后测24h尿蛋白定量＜10mg/24h，随机分成对照组（S组）、模型组(M组)、贝那普利组(L组)、低剂量中药组(A组)、中剂量中药组(B组)、高剂量中药组(C组)，每组各10只。采用被动型Heymann肾炎动物模型[7]作为模型，S组大鼠尾静脉注射一次性生理盐水6ml/kg，其余各组大鼠按照6mg/kg的剂量，一次性尾静脉注射Anti-Fx1A进行造模，1周后大鼠24小时尿蛋白＞10mg/kg即认定造模成功。

1.2 药物与试剂：加减补阳还五汤（生黄芪、猫人参各30g，桃仁、山萸肉各10g，川牛膝、地龙、生地、赤芍、怀山药各15g，当归、川芎各9g，制大黄、红花、陈皮各6g，土茯苓20g）煎剂，由浙江中医药大学饮片炮制中心提供，浓度分别为1.76g/ml、3.52g/ml、7.04g/ml。抗近端小管刷状缘抗原（Anti-Fx1A）购于PROBETEX公司（批号：PTX-002S）；盐酸贝那普利片购于北京诺华制药有限公司（规格：10mg/片；批号：X2342）；TGF-β1抗体、VEGF抗体、MMP-9抗体均购于Santa公司（批号：sc-52893、sc-7269、sc-13520）；BDA显色盒（批号：ZLI-9019）、超敏二步法免疫组化试剂盒均购于北京中杉金桥公司（批号：PV-6001）。BX51光学显微镜购于日本Olympus公司；微量移液枪购于德国Eppendorf公司。

1.3 给药：大鼠造模成功后开始给药，灌胃每日早晚各1次，共4周。S和M组给0.9%氯化钠溶液10ml/kg，L组给予贝那普利溶液1.67mg/kg[8]，A、B、C组分别给予17.6g/(kg·d)、35.2g/(kg·d)、70.4g/(kg·d)加减补阳还五汤水煎剂，剂量为60kg体质量正常成人每日生药剂量的5、10、20倍[9]。

1.4 标本采集：给药前和给药后4周，使用清洁代谢笼收集大鼠24h尿液，记录尿量，检测24h尿蛋白定量；以10%水合氯醛3.5mg/kg腹腔注射，麻醉后腹主动脉采血，3000r/min离心10min分离血清，检测血浆白蛋白。摘取肾脏，剥除包膜，留取肾组织，于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋切片。

1.5 观察指标：分述如下。

1.5.1 血尿指标检测：检测大鼠基础、给药前、给药后1周和4周24h尿蛋白定量及给药后血浆白蛋白水平。

1.5.2 肾脏组织病理改变观察及TGF-β1、VEGF、MMP-9表达检测：各组肾组织常规PASM染色，光镜下观察肾小球的病理变化。免疫组化检测TGF-β1、VEGF、MMP-9表达。每张切片随机选取6个非重叠视野，注意避开边缘，使用Image Pro Plus软件进行平均累积光密度值（IOD），取其平均值进行统计分析。

1.6 统计学方法：采用统计软件SPSS 17.0分析，本研究计量资料均符合正态分布，以±s表示，均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。方差不齐时采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血浆白蛋白检测结果和24h尿蛋白定量结果比较：造模后，造模组大鼠较S组大鼠，各时间点的24h尿蛋白定量均明显升高（P＜0.05）。给药后2个时间点的4个给药组比M组的24h尿蛋白定量均有明显降低（P＜0.05）。详见表1。

表1 各组大鼠24h蛋白尿和血浆白蛋白水平比较（±s）

表1 各组大鼠24h蛋白尿和血浆白蛋白水平比较（±s）

注：与S组比较，*P＜0.05；与M组比较，△P＜0.05。

分组S组M组L组A组B组C组例数10 10 10 10 10 10基础24h蛋白尿（mg/24h）3.31±1.38 2.52±1.91 2.81±1.05 2.94±1.23 2.98±1.34 3.14±1.51给药前24h蛋白尿（mg/24h）7.15±3.40 31.81±6.87*26.10±6.64*△29.79±7.80*△28.11±9.09*△26.91±8.76*△给药后7天24h蛋白尿（mg/24h）8.01±3.96 84.29±11.31*52.47±10.41*△51.49±10.67*△50.55±9.22*△49.53±8.72*△给药后28天24h蛋白尿（mg/24h）9.52±3.61 76.03±9.53*43.57±10.48*△40.61±9.73*△41.09±10.87*△41.52±7.69*△血浆白蛋白(g/L）37.36±2.37 36.58±2.26 36.81±2.60 37.79±2.46 37.08±2.12 37.40±2.86

2.2 各组大鼠肾脏组织PASM染色比较：对照组未见明显异常，其余各造模组肾小球体积增大，基底膜轻度增厚，毛细血管壁僵硬，可见上皮下“钉突”形成；肾小管上皮细胞呈空泡变性，偶有刷状缘脱落。见图1。

图1 各组大鼠肾脏组织病理学改变（PASM染色，×400）

2.3 各组大鼠TGF-β1、VEGF、MMP-9表达的比较：与S组比较，其余5组大鼠肾组织TGF-β1、MMP-9和VEGF表达均明显增高（P＜0.05）。与M组比较，L组和A、B、C 3个组TGF-β1和VEGF表达均减低（P＜0.05）。与M组比较，L组和A、B、C 3个组MMP-9表达均增加（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肾组织TGF-β1、VEGF、MMP-9表达水平的比较（IDO值）（±s）

表2 各组大鼠肾组织TGF-β1、VEGF、MMP-9表达水平的比较（IDO值）（±s）

注：与S组比较，*P＜0.05；与M组比较，△P＜0.05。

分组S组M组L组A组B组C组MMP-9 0.011±0.004 0.057±0.012#0.096±0.007*△0.098±0.008*△0.094±0.008*△0.094±0.007*△例数10 10 10 10 10 10 TGF-β1 0.012±0.004 0.180±0.014*0.108±0.008*△0.103±0.010*△0.105±0.011*△0.108±0.010*△VEGF 0.012±0.003 0.166±0.011#0.101±0.012*△0.101±0.011*△0.103±0.013*△0.104±0.010*△

3 讨论

IMN临床表现以大量蛋白尿为主，足细胞的损伤和脱落与蛋白尿的发生密切相关，是肾小球硬化形成和发展的关键因素[10-11]。目前已证实细胞因子如TGF-β1、VEGF等均能够引起足细胞的EMT，其中TGF-β1是最主要的致细胞EMT因素，对以足细胞损害为主的肾小球疾病发生进展中起关键作用[12-13]。IMN在病理上以肾小球基底膜（GBM）的形态改变和弥漫性增厚以及钉突形成为主，GBM的增厚形态改变除免疫复合物形成的影响外，还包括IV型胶原、纤维连接蛋白和硫酸类肝素蛋白多糖等细胞外基质（ECM）成分的增多与聚积。MMP-9参与细胞外基质的降解和转运，如果MMP-9表达异常，IV胶原合成和降解失衡，基底膜重塑障碍，会导致蛋白尿发生[14]。

加减补阳还五汤以清代医家王清任所创的补阳还五汤为基础方。原方中重用黄芪补益元气，气旺则血行，瘀去络通，为君药；当归活血通络而不伤血，为臣药；赤芍、川芎、桃仁、红花协当归以活血祛瘀；地龙通经活络，力专善走，周行全身，以行药力。在此基础上，笔者根据临床经验加土茯苓、猫人参以清热解毒除湿，加生地、山萸肉、山药以滋肾养阴；川牛膝、制大黄祛瘀活血；陈皮理气燥湿，助行气化瘀，并滋而不腻，共为佐药。诸药合用，共奏益气行血化瘀，滋阴清热除湿之功。

课题采用被动型Heymann肾炎大鼠模型，给予高、中、低剂量的加减补阳还五汤或贝那普利干预，研究表明加减补阳还五汤能够在一定程度上减少膜性肾病大鼠蛋白漏出，减轻足细胞损伤及上皮间质转化，经过加减补阳还五汤或贝那普利干预的膜性肾病大鼠血清白蛋白较模型组明显升高，24h尿蛋白定量及TGF-β1、VEGF的表达较模型组均明显减少，而MMP-9的表达增加；与贝那普利组比较，加减补阳还五汤低、中、高3个剂量组血清白蛋白、24h尿蛋白定量差异无统计学意义，TGF-β1、VEGF、MMP-9的表达差异亦无统计学意义（P＞0.05），说明3个剂量组的加减补阳还五汤对膜性肾病大鼠的治疗作用与贝那普利相当。由此笔者推测，加减补阳还五汤能够通过减少TGF-β1、VEGF的表达，上调MMP-9的表达，减少足细胞损伤及EMT，减少减少尿蛋白的漏出，从而延缓肾脏疾病的进展。

通过一系列研究，证实加减补阳还五汤具有较好的保护足细胞减少蛋白尿作用，加减补阳还五汤作用与贝那普利相当，其作用机制可能与下调TGF-β1、VEGF的表达，上调MMP-9的表达有关，但更细致的分子作用机制尚需更深入的研究。