加味竹叶石膏汤对急性痛风性关节炎大鼠Toll样受体抗炎作用的机制研究*

舟山医院 浙江 舟山 316021

痛风是由单钠尿酸盐晶体诱发的炎症性疾病[1]。加味竹叶石膏汤临床上治疗湿热内蕴型痛风，并取得了显著的效果。本研究旨在通过观察加味竹叶石膏汤在大鼠痛风模型中的应用效果，及对Toll样受体（TLR）、炎症相关因子水平的变化，从而探讨其抗炎作用机制。报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物：选取清洁级SD大鼠90只（江苏集萃药康生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2018-0008；实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2018-0027），雄性，体质量180±20g，适应性喂养1周后，随机分为空白组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组18只。所有大鼠统一饲养于实验室中，温度20±2℃，湿度60%～70%，光暗周期（12h/12h）每4只大鼠一笼自由活动。

1.2 研究方法：分述如下。

1.2.1 动物造模：模型诱导方法：分组后，除空白组，其余4组小鼠经2.5%异氟烷麻醉后，以碘酒、乙醇消毒局部，用1ml灭菌注射针在小鼠右侧距小腿(踝关节背侧，从45°方向插入至胫骨肌腱内侧，将含0.5mg尿酸钠溶液20μl注入到关节腔，正常对照组注射20μl磷酸缓冲盐溶液（PBS），4天后处理小鼠，进行指标检测。

1.2.2 中药配置和给药剂量：加味竹叶石膏汤组成：淡竹叶、麦门冬各12g，生石膏、薏苡仁各30g，知母、半夏各10g，北沙参、土茯苓各15g，甘草6g。除生石膏外其余药物冷水浸泡30分钟，武火煎煮至沸腾状态后改文火煎煮30分钟，滤出药汁后加水复煎30分钟，将2次药汁混合共800ml。成人药量低剂量为150ml/次，中剂量为200ml/次，高剂量为250ml/次，根据70kg人与200g大鼠药物剂量换算标准，低剂量组为2.68ml/次，中剂量组为3.57ml/次，高剂量组为4.46ml/次，每日早、中、晚各1次。模型组同期给予约3.5ml0.9%氯化钠溶液，空白组不给予任何药物。

1.2.3 观察指标：所有大鼠在造模96h后（禁食不禁水12h）腹腔注射10%水合氯醛3.5ml/kg进行麻醉，取腹主动脉血3ml静置1h后，离心取上清液，置于-20℃冰箱中保存待检。血液收集完成后，脱颈处死，取受试关节于4%多聚甲醛中固定，7d后进行脱钙处理。血液检测指标包括血清尿酸（BUA）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6），均采用ELISA检测，受试关节脱钙处理后取组织切片、HE染色后采用免疫组化法检测踝关节滑膜组织TLR2、TLR4蛋白表达。

1.3 统计学方法：采用SPSS 24.0软件进行统计学处理。所有检测结果均为计量资料，以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血液检测结果比较：与空白组相比，其他各组BUA、IL-1β、IL-6水平均增高（P＜0.05）；与模型对照组相比，治疗后低、中、高剂量治疗组BUA、IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05）；与低、中剂量组相比，高剂量治疗组IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05）；低、中剂量组治疗后IL-1β、IL-6水平无明显差异（P＞0.05）；低、中、高剂量治疗组治疗后BUA水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血液检测结果比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与低、中剂量组比较，▲P＜0.05。

IL-6（pg/ml）34.82±10.05 69.30±6.42*65.31±5.48*△64.02±4.27*△55.32± 7.18*△▲组别空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组BUA（μmol/L）193.21±22.45 280.14±30.95*234.14±19.02*△220.29±11.16*△223.05±11.10*△IL-1β（pg/ml）3.01±1.54 5.23±1.30*4.97±1.29*△4.92±1.52*△4.46±1.23*△▲

2.2 各组大鼠踝关节滑膜组织中TLR2、TLR4蛋白的表达比较：与空白组相比，其他各组TLR2、TLR4阳性细胞比例、蛋白表达水平均增高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，治疗后低、中、高剂量治疗组TLR2、TLR4阳性细胞比例、蛋白表达水平降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与低、中剂量组相比，高剂量组TLR2、TLR4阳性细胞比例、蛋白表达水平降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；低、中剂量组治疗后TLR2、TLR4阳性细胞比例、蛋白表达水平水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠踝关节滑膜组织中TLR2、TLR4蛋白的表达比较（±s）

表2 各组大鼠踝关节滑膜组织中TLR2、TLR4蛋白的表达比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与低、中剂量组比较，▲P＜0.05。

组别空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组TLR2 TLR4例数18 18 18 18 18 TLR4蛋白表达1.02±0.37 3.67±0.61*3.02±0.25*△2.79±0.30*△2.58±0.21*△▲阳性细胞（%）11.02±2.48 35.68±7.62*30.01±2.73*△28.42±2.76*△27.35±2.08*△▲染色强度0-1 2-3 1-2 1-2 1-2 TLR2蛋白表达1.21±0.28 3.53±0.78*2.99±0.31*△2.91±0.29*△2.72±0.19*△▲阳性细胞（%）10.29±4.59 36.34±5.79*30.38±2.49*△28.73±3.35*△26.52±1.93*△▲染色强度0-1 2-3 1-2 1-2 1-2

3 讨论

痛风中医学中可归属于“热痹”范畴，主要与素体禀赋不足，或调摄不慎，长期嗜欲膏粱厚味，日久导致脾胃运化失常，湿热内蕴有关。本病有别于一般“痹病”之风寒湿邪入侵，故治宜清热化湿的同时，兼顾健脾养阴。《伤寒论》之竹叶石膏汤方中石膏、竹叶清热除烦，人参、麦冬益气养阴，半夏降逆，粳米和中。由于痛风发病和湿热内聚、脾失健运密切相关，故将原方人参易为北沙参，去粳米加用薏苡仁、土茯苓，重在清热泻火、养阴除烦同时兼顾健脾和中、渗湿化浊。古方新用，具有清补两顾、清热兼健脾、补虚不恋邪的特点，适用于急性痛风性关节炎湿热蕴结型。

研究表明，在诸多炎症因子中，IL-1β已成为痛风发病过程中的关键因子，对于痛风炎症网络调控发挥着重要的作用[1]。痛风急性发作时关节腔内已形成微晶体沉淀，而该沉淀物的来源为尿酸钠[2-3]，Toll样受体作为组织细胞表面的感应器，对尿酸钠微晶体具有较高的敏感性，可迅速激活免疫应答，通过一系列细胞结合、细胞活化、细胞激活等作用，最终启动IL-1β的表达，使炎症反应逐渐加剧，并出现炎症临床表现。因此从理论上分析，Toll受体相关因子水平可提示尿酸钠微晶体的沉积量是否足以引发痛风症状，其中TLR2、TLR4是Toll受体的代表因子，目前已有研究证实TLR2、TLR4与痛风症状的发生及缓解有直接的关系[4]。

我们既往的研究显示，加味竹叶石膏汤能够通过NLRP3炎症信号传导通路的调控作用，抑制TNF-α、Caspase-1等炎症因子的水平，显著改善关节肿胀程度和炎症指数[5-6]。为进一步探讨加味竹叶石膏汤在急性痛风性关节炎中的抗炎作用机制，本次研究对痛风模型大鼠Toll受体相关因子及炎性因子进行观察，结果显示痛风急性发作后在血尿酸、IL-1β和IL-6水平升高的同时，以TLR2、TLR4为代表的Toll受体阳性细胞数及蛋白表达也随之升高，这与Toll受体对尿酸升高后尿酸钠沉积微晶体的敏感性有关。通过加味竹叶石膏汤治疗后，大鼠BUA、IL-1β和IL-6水平降低，并且TLR2、TLR4的阳性细胞数及蛋白表达也明显降低，由此提示加味竹叶石膏汤对于改善急性痛风大鼠BUA水平及炎性反应有显著的效果，其作用机理与Toll免疫应答机制有关，以目前的研究结果推测，加味竹叶石膏汤可抑制关节滑膜腔中TLR2、TLR4蛋白的表达，减少尿酸钠微晶体的堆积，从而起到缓解炎症反应的效果。而通过对不同剂量加味竹叶石膏汤的作用效果比较，较高剂量药物作用在短期内效果更佳。

由此，笔者认为在痛风急性期应用加味竹叶石膏汤具有可行性和有效性，而且作用机制与Toll受体的免疫应答有密切的关系。