姜黄素类似物对糖尿病肾病小鼠肾纤维化的影响及机制探讨

刘瑾 沈婷婷 蒋洁莹 郁韶明

摘要  目的：探討姜黄素类似物对糖尿病肾病（DN）小鼠肾纤维化的影响及机制。方法：KKAy小鼠给予高脂饲料连续饲养2周构建DN小鼠模型，随机分为模型组和实验组，每组12只，10只C57BL/6J小鼠饲喂普通饲料，作为正常组。实验组小鼠灌胃姜黄素类似物H8 5 mg/kg，模型组和正常组均灌胃等量生理盐水，1次/d，连续干预6周。采用血糖仪检测小鼠空腹血糖（FBG），双缩脲法检测处死前24 h尿液尿蛋白（UP）;过碘酸-无色品红染色（PAS染色）观察小鼠肾组织病理形态变化;蛋白免疫印迹（WB）法及实时荧光定量-聚合酶链式反应（qPCR）检测各组小鼠肾组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤连蛋白（FN）和IV型胶原（Col-Ⅳ）、Twist蛋白表达情况。结果：干预后，正常组、模型组和实验组小鼠肾脏指数（KI）分别为（6.24±0.32）、（14.4±2.39）、（9.14±1.43）mg/g，FBG分别为（4.96±1.25），（35.54±3.43），（27.54±1.12）mmol/L，24 h UP分别为（31.69±5.51）、（710.54±231.28）、（410.43±130.36）μmol/L;肾小球硬化评分分别为（0.00±0.00）、（3.02±0.24）、（1.69±0.21）分，组间差异有统计学意义（ P <0.05）。与正常组比较，模型组小鼠肾组织α-SMA、FN和Col-Ⅳ、Twist蛋白及mRNA相对表达量升高（ P <0.05），而实验组小鼠低于模型组（ P <0.05）。结论：姜黄素类似物可改善DN小鼠肾功能及肾组织损伤程度，降低纤维化蛋白表达，延缓肾组织纤维化，可能与下调Twist蛋白表达有关。

关键词  糖尿病肾病;姜黄素类似物;Twist蛋白;纤维化;肾组织病理;肾组织病理;纤连蛋白;IV型胶原;Twist蛋白

Exploration on Effects of Curcumin Analogs on Renal Fibrosis in Diabetic Nephropathy Mice and Its Mechanism

LIU Jin，SHEN Tingting，JIANG Jieying，YU Shaoming

（Manufacturing Laboratory，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200021，China）

Abstract Objective： To explore effects and mechanism of curcumin analogs on renal fibrosis in diabetic nephropathy（DN）mice. Methods： KKAy mice were fed with high-fat diet for 2 weeks to establish DN mice model.They were randomly divided into model group and test group，with 12 mice in each group.Ten C57BL/6J mice were fed with common diet as normal group.Mice in the test group were given 5 mg/kg curcumin analogs H8 by gavage，and mice in the model group and the normal group were given the same amount of saline，once a day for 6 weeks.Fasting blood glucose（FBG）was measured by blood glucose meter.Before execution，24 h urinary protein（UP）was measured by biuret method.Renal histopathological changes were observed by periodic acid-Schiff staining（PAS staining）.Expressions of α-smooth muscle actin（α-SMA），fibronectin（FN），collagen IV（Col-IV）and Twist protein in renal tissue of mice in each group were measured by western blot（WB）and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction（qPCR）. Results： After the intervention，the kidney index（KI）of mice in the normal group，the model group and the test group was（6.24±0.32），（14.4±2.39）and（9.14±1.43）mg/g，respectively.The FBG was（4.96±1.25），（35.54±3.43）and（27.54±1.12）mmol/L，respectively.The 24 h UP was（31.69±5.51），（710.54±231.28）and（410.43±130.36）μmol/L，respectively.The glomerulosclerosis score was（0.00±0.00），（3.02±0.24）and（1.69±0.21），respectively.There was statistically significant difference between the groups（P < 0.05）.Compared with the normal group，the relative expressions of α-SMA，FN，Col-IV，Twist protein and mRNA in kidney tissue of the model group mice were increased（P < 0.05），while those in the test group were lower than those in the model group（P < 0.05）. Conclusion： Curcumin analogs can improve renal function and damage degree of renal tissue in DN mice，decrease the expression of fibrosin and delay renal fibrosis，which may be related to down-regulation of Twist protein expression.

Keywords  Diabetic nephropathy; Curcumin analogs; Twist protein; Fibrosis; Renal histopathology; Renal histopathology; Fibronectin; Collagen IV; Twist protein

中图分类号：R285.5 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.04.017

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）已经成为导致糖尿病患者终末期肾脏衰竭的最主要原因，与遗传因素、血流动力学异常、炎性反应等导致的血管活性物质和细胞因子代谢异常、氧化应激等有关，逐步导致肾脏的纤维化[1-2]。姜黄素是由姜科植物根茎中提取的酚类化合物，具有广泛的药理活性，但代谢速度较快、生物利用度低[3];姜黄素衍生物H8保留了姜黄素母体结构，但更易溶于水、稳定性强、生物利用度高[4]。本研究即探讨姜黄素类似物H8对DN小鼠肾纤维化病变的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF雄性KKAy小鼠，24只，8～10周龄，体质量（30.0±2.5）g，C57BL/6J小鼠，12只，9～11周龄，体质量（25.0±2.5）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0011;于室温22～25 ℃，湿度50%～65%，12 h明暗交替环境下饲养约6 d，完全适应新环境后进行实验研究。

1.1.2 药物 姜黄素类似物H8（由福建医科大学药学院提供）。

1.1.3 试剂与仪器 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）（批号：20180802），纤连蛋白（FN）（批号：20196234），购自上海联迈生物工程有限公司;IV型胶原（Col-Ⅳ）（批号：196358）、Twist抗体（批号：183654），购于美国Cell Signaling Technology公司;血糖仪（美国强生公司，型号：OneTouchsurestep）;光学显微镜（日本Olympus公司，BX51F32H01型）;凝胶成像系统（美国Genesis公司，型号：Gel-Pro 2020D）等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 KKAy小鼠给予高脂饲料连续饲养2周，若血糖≥13.9 mmol/L，则表明DN建立成功，C57BL/6J小鼠饲喂普通饲料，作为正常组。将DN小鼠随机分为模型组和实验组，每组12只[5]。

1.2.2 给药方法 实验组小鼠灌胃姜黄素类似物H8 5 mg/kg，模型组和正常组均灌胃等量生理盐水，1次/d，连续干预6周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 各组小鼠血清生化指标比较 干预后称重小鼠体质量，采用血糖仪检测所有小鼠空腹血糖（FBG），代谢笼收集小鼠处死前24 h尿液，双缩脲法检测尿蛋白（UP）用，尿总蛋白量为24 h尿量与尿蛋白浓度的乘积，采用全自动生化分析仪检测血清肌酐（CREA）和尿素（URE）。

1.2.3.2 过碘酸-无色品红染色（PAS染色）观察各组小鼠肾组织病理形态变化 断头法处死小鼠，取左侧肾脏，去除肾包膜，称重后计算肾脏指数（KI）=肾质量（mg）/体质量（g）;4 ℃生理盐水洗涤，将1部分肾组织置于4%多聚甲醛中固定，其余肾组织于-70 ℃冰箱保存。肾组织常规石蜡包埋。每组取3张切片进行常规PAS染色，于光学显微镜下观察并记录肾组织的病理变化，参照相关文献对肾小球硬化程度进行评分[6]。

1.2.3.3 蛋白免疫印迹（WB）法[7]及实时荧光定量-聚合酶链式反应（qPCR）[8]检测各组小鼠肾组织相关蛋白表达情况 取保存于-70 ℃冰箱的肾组织，提取肾组织总蛋白，经BCA法定量，参照相关文献检测肾组织中α-SMA、FN和Col-Ⅳ、Twist蛋白及mRNA，统计其相对表达量。各组均测量3次并取平均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以 （ ±s） 表示，2组间比较进行 t 检验，以 P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠观察比较 与正常组小鼠比较，模型组和实验组小鼠体毛缺乏光泽，且均有精神不振、活动迟缓现象，并出现多饮、多食、多尿，但实验组小鼠上述情况较模型组均有所改善。正常组、模型组和实验组小鼠KI分别为（6.24±0.32）、（14.4±2.39）、（9.14±1.43）mg/g。与正常组比较，模型组大鼠KI明显增加（ P <0.05）;与模型组比较，实验组KI明显降低（ P <0.05）。见表1。

2.2 各组小鼠血液生化检测指标比较 与正常组比较，模型组大鼠血清FBG、24UP、URE明显升高，CREA明显降低，实验组血清FBG、24UP、URE明低于模型组，CREA明显高于模型组（ P <0.05）。见表2。

2.3 各组小鼠鼠肾组织病理变化 正常组、模型组和实验组肾小球硬化评分分别为（0.00±0.00）分、（3.02±0.24）分、（1.69±0.21）分，模型组肾小球硬化评分高于正常组（ P <0.05），实验组低于模型 组（ P <0.05）;模型组和实验组小鼠出现肾小球肥大，系膜区增宽，基底膜增厚，肾间质充血，近曲小管上皮细胞空泡变性及炎性细胞浸润等;实验组上述病理改变均减轻。见图1。

2.4 各组小鼠肾组织相关蛋白表达 与正常组比较，模型组小鼠肾组织α-SMA、FN和Col-Ⅳ、Twist蛋白及mRNA相對表达量升高（ P <0.05），而实验组小鼠低于模型组（ P <0.05）。见图2，表3、4。

3 讨论

目前糖尿病和DN已成为威胁人类健康的重要疾患，DN疾病进程中主要病理特征为肾小管间质纤维化，其中肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化发挥着关键作用[9-10]。糖尿病进展过程中肾小管间质发生了上皮-间充质转化，促进了肾功能的恶化，因此逆转上皮-间充质转化的发展对于延缓DN等慢性肾脏疾病具有重要的意义[11-12]。近年来中药及其单体成分抗纤维化的研究日益增多;姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及抗纤维化的多种功能，可抑制炎性反应因子的产生，保护内皮细胞免受肿瘤坏死因子-α损伤，在风湿性关节炎、炎性反应性肠道疾病、1型糖尿病等疾病的治疗中显示出较好的治疗作用[13-14]。陈泽等[15]研究显示，姜黄素衍生物C66能有效抑制鼠肝星状细胞增殖及胶原合成，具有一定的防治肝纤维化的作用。

本研究结果显示，与模型组比较，实验组KI明显降低，血清FBG、24UP明显降低，提示姜黄素衍生物H8可改善DN小鼠腎功能及肾组织损伤程度。Twist基因为一种癌基因，在多种实体肿瘤中高表达，能够促使上皮细胞向间充质细胞转分化，是多种肿瘤细胞发生侵袭和转移的关键调控因子[16];目前研究[17]发现，Twist促进上皮-间充质转化的进展参与某些器官纤维化。Kida等[18]在UUO肾纤维化模型中发现，Twist表达量与上皮-间充质转化的发生率呈正相关。He等[19]用高糖刺激人腹膜间质细胞，发现Twist基因大量表达，通过与下游的YB-1基因作用，激活靶基因的E-box，导致细胞发生纤维化。从本研究的结果可以看出，姜黄素衍生物H8干预后改善了DN小鼠肾功能及肾组织损伤程度，降低织α-SMA、FN和Col-Ⅳ纤维化蛋白表达，延缓肾组织纤维化，分析其可能与下调Twist蛋白表达有关。

参考文献

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（2020-02-05收稿 责任编辑：王明）

基金项目：上海市卫生和计划生育委员会科技项目（20144Y016）作者简介：刘瑾（1970.03—），女，硕士，副主任药师，研究方向：中药制剂，E-mail：873231876@qq.com通信作者：郁韶明（1961.04—），女，本科，副主任药师，研究方向：临床新药研究，E-mail：568976178@qq.com