脑膜瘤组织中miR-190和FOXP2表达及其与患者预后的关系

李雄飞，胡伟，周明安，田少斌

脑膜瘤发于脑膜及脑膜间隙的中枢神经系统，多为良性，具有生长缓慢、病程长等特点。脑膜瘤在中老年人群发病较高，且女性发病率高于男性。由于外界环境影响，近年来脑膜瘤发病率逐年递增，严重影响人类健康及生活质量。若不能得到有效治疗，脑膜瘤患者易出现复发或肿瘤恶性进展，降低患者生存率[1]。虽然脑膜瘤影响因素相关研究已较多，但在分子层面探究脑膜瘤患者预后相关因子，对确定治疗方案及改善患者预后仍具有重要意义。有研究表明，微小RNA(miR)-190在乳腺癌中表达下调，可抑制乳腺癌的体内外转移，其表达水平与乳腺癌患者预后有关[2]。宋默等[3]研究表明，miR-190在结直肠癌组织中表达水平显著降低，与结直肠癌细胞生长和转移有关，miR-190在结直肠癌进展中起抑癌作用。研究报道，叉头框蛋白P2(FOXP2)在肝癌组织中表达下调，显著增强癌细胞侵袭性，FOXP2低表达与总体生存率较差有关[4]。Chen等[5]研究发现，乳腺癌细胞中下调FOXP2能促进癌细胞增殖、迁移，FOXP2表达降低与恶性乳腺癌发生及患者不良预后有关。miR-190与FOXP2表达均与肿瘤内皮间充质转化有关[6-7]，然而二者与脑膜瘤预后的关系尚不清楚。现分析脑膜瘤中miR-190与FOXP2表达水平，及其与脑膜瘤患者临床病理特征及预后的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2009年8月—2014年10月湖北省天门市第一人民医院神经外科诊治脑膜瘤患者108例作为研究对象，其中男33例，女75例，年龄31～79(58.33±12.57)岁； 病程10 d～5年，平均(2.34±0.72)年；基础病：高血压、糖尿病16例；有脑颅外伤史23例；有家族遗传史10例。根据世界卫生组织(WHO)分类标准[8]：Ⅰ级(良性)73例，Ⅱ～Ⅲ级(非典型性、退行性或恶性)35例；按肿瘤直径分类：>4 cm 60例，≤4 cm 48例；按手术切除率分类：全部切除69例，部分切除39例。本研究已经过医院伦理委员会批准同意，患者及其家属对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①经MR诊断确诊为脑膜瘤；②入院治疗前未进行放、化疗者；③临床资料完整。(2)排除标准：①非首次患肿瘤者；②合并患有其他部位肿瘤者；③患有严重精神疾病者；④心、肾、肝脏功能严重不足者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 样本采集：术中收集脑膜瘤患者癌组织及相应癌旁组织(距病灶>2 cm)，一部分放入液氮中迅速冷冻后立即放入-80℃冰箱保存，用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)；另一部分经10%福尔马林溶液固定，制成4 μm厚切片，用于免疫组织化学染色。

1.3.2 qRT-PCR检测miR-190、FOXP2 mRNA相对表达量： 使用RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取总RNA后，经反转录(试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司)得到cDNA，使用7500 Fast型qRT-PCR仪(美国ABI公司)及qRT-PCR试剂盒(北京宝日医生物技术有限公司)进行实验。qRT-PCR 20 μl 反应体系如下，SYBR Premix Ex TaqTM(2×) 10 μl，ROX Reference Dye(50×)0.4 μl，上游引物0.8 μl，下游引物0.8 μl，cDNA 2 μl，dH2O 6 μl。qRT-PCR反应程序如下：95℃、30 s，1个循环；95℃、5 s,63℃、34 s， 40个循环。一个样品设置3次重复，使用2-△△CT法计算miR-190、FOXP2 mRNA相对表达量。miR-190以U6为内参基因，FOXP2以GAPDH为内参基因。引物由北京宝日医生物技术有限公司合成，见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 免疫组织化学染色检测FOXP2蛋白表达水平：使用免疫组织化学染色试剂盒(上海优予生物科技有限公司)检测。鼠抗人FOXP2多克隆抗体购自亚诺法生技股份有限公司，羊抗鼠二抗购自上海优予生物科技有限公司；严格按照试剂盒说明书进行操作。DM2700型显微镜(德国徕卡公司)400倍下观察染色结果，并采集图像资料，镜下选取6个视野进行阳性细胞计数。

染色结果判定：细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒为FOXP2蛋白表达阳性细胞。分别根据染色强度和阳性细胞比例记分。(1)染色强度：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。(2)阳性细胞比例：以<5%为0分，≥5%且≤25%为1分，>26%且≤50%为2分，>51%且≤75%为3分，>75%为4分。两类记分相乘，0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)，将阴性(-)、弱阳性(+)定义为FOXP2蛋白低表达，阳性(++)、强阳性(+++)定义为FOXP2蛋白高表达。

1.4 随访 脑膜瘤患者经手术或放射治疗出院后，以电话或复查形式进行5年随访，随访期间主要观察患者是否有不良事件(复发或死亡)发生，分析患者5年无瘤生存情况。

2 结 果

2.1 miR-190、FOXP2 mRNA表达水平比较 脑膜瘤组织中miR-190、FOXP2 mRNA表达水平均显著低于癌旁组织(P均<0.01)，见表2。

表2 脑膜瘤组织和癌旁组织miR-190、 FOXP2 mRNA表达量比较

2.2 FOXP2蛋白表达水平比较 FOXP2蛋白主要在细胞核中表达，脑膜瘤组织中FOXP2蛋白阳性表达率显著低于癌旁组织(67.59%vs.90.74%，χ2=17.544，P=0.000)，见图1。

图1 脑膜瘤组织和癌旁组织中FOXP2蛋白染色结果 (免疫组织化学染色，×400)

2.3 不同临床特征患者miR-190 mRNA、FOXP2蛋白表达水平比较 将脑膜瘤组织以miR-190表达水平平均数(0.64)和FOXP2蛋白免疫组化染色结果分为高表达和低表达亚组。脑膜瘤组织中miR-190、FOXP2蛋白高/低表达水平在不同性别、年龄、病程、有无患基础病、有无脑颅外伤史、有无家族遗传史、肿瘤直径、手术切除方式及是否接受放射治疗患者中比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而在WHO分级、术前脑干是否水肿方面比较，差异有统计学意义(P均<0.01)，见表3。

2.4 miR-190、FOXP2高/低表达脑膜瘤患者预后比较 Kaplan-Meier分析结果显示，miR-190高表达亚组5年无瘤生存率为58.33%，高于miR-190低表达亚组的28.33%(χ2=10.170，P=0.001)；FOXP2高表达亚组为72.09%，高于FOXP2低表达亚组的33.85%(χ2=11.290，P=0.001)，见图2。

2.5 脑膜瘤患者预后影响因素分析 单因素Cox回归分析结果显示，性别、年龄、肿瘤直径与脑膜瘤患者预后无关(P均>0.05)，无放射治疗、术前脑干水肿、部分切除、WHO分级高、miR-190低表达、FOXP2低表达是影响脑膜瘤患者不良预后危险因素(P均<0.05)，见表4。

3 讨 论

日常生活中有害化学物质、放射性照射、机械性颅脑损伤、病毒感染、基因突变等均可能引发脑膜瘤。脑膜瘤早期症状有头痛、视力下降、肢体无力等，随着疾病进展，患者易出现智力下降、癫痫、肢体运动障碍等症状，严重者危及生命[9-10]。脑膜瘤患者经手术治疗或放射治疗后生存期较长，但肿瘤切除不完全、患者术后情绪差等因素易导致复发或死亡等不良预后[11-14]。因此，寻找脑膜瘤预后标志物对于有效评估患者预后、提高患者生存率、延长生存时间有一定帮助[15-16]。

表3 脑膜瘤组织中miR-190、FOXP2高/低表达水平在不同临床特征中的比较 [例(%)]

图2 5年无瘤生存率分析 表4 影响脑膜瘤患者预后不良危险因素Cox回归分析

变 量β值SE值Wald值P值HR值(95%CI)性别0.5060.5240.9310.2411.658(0.594～4.628)年龄0.6300.4561.9070.2121.877(0.768～4.635)肿瘤直径0.5610.3612.4130.2031.752(0.863～3.557)放射治疗0.8950.3985.0600.0462.448(1.121～5.347)术前脑干是否水肿1.0040.3996.3400.0312.731(1.245～5.989)切除方式1.0010.3826.8620.0352.720(1.284～5.763)WHO分级1.1970.32313.7390.0213.311(1.758～6.236)miR-1901.2630.39010.4920.0133.537(1.649～7.587)FOXP21.3720.39412.1250.0083.943(1.823～8.257)

微小RNA(miRNA)是一种能稳定存在于人体组织和细胞内的短链非编码RNA，具有调控肿瘤进展功能。研究发现，miR-219在脑膜瘤组织中低表达，与脑膜瘤患者高复发率显著相关[17]。非典型性脑膜瘤细胞中miR-145表达水平明显低于良性脑膜瘤细胞，过表达miR-145可导致癌细胞增殖减少、凋亡增加[18]。以上研究提示，miRNA可能参与脑膜瘤进展，且与患者预后有关。Yu等[6]研究报道，miR-190在肝癌组织中低表达，miR-190可通过抑制上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，抑制癌细胞迁移和侵袭。本结果显示，miR-190在脑膜瘤组织中表达水平显著降低，与Yu等[6]在miR-190与肝癌进展关系研究中发现相似，提示miR-190下调可能与脑膜瘤发生有关。有研究表明，胃癌细胞中miR-190下调，过表达miR-190能显著降低胃癌细胞生存能力[19]。本研究发现，脑膜瘤组织中miR-190表达水平与WHO分级有关，提示miR-190可能参与调控脑膜瘤发展，miR-190可能通过影响EMT过程，抑制肿瘤细胞增殖和侵袭能力，在脑膜瘤发生中起阻碍作用。有研究报道，miR-190通过靶向Smad2下调TGF-β诱导的EMT过程，抑制乳腺癌体内外转移[20]，提示本研究中miR-190可能通过靶向调控Smad2、TGF-β等EMT上游信号因子表达，参与脑膜瘤进展。Xu等[21]研究表明，miR-190在前列腺癌组织中显著降低，miR-190低表达与患者无瘤生存率降低有关。本研究结果中，miR-190低表达亚组5年无瘤生存率显著降低，与Xu等[21]在前列腺癌组织中研究结果一致，提示miR-190表达水平降低可能与肿瘤增殖和迁移能力增加引起的脑膜瘤患者病死率增加有关。

Diao等[22]研究表明，胰腺导管腺癌中FOXP2表达下调，与癌细胞增殖和侵袭能力增强有关，可能是胰腺导管腺癌潜在诊断和治疗靶点。FOXP2在胶质瘤细胞中表达水平明显低于正常星型胶质细胞，上调FOXP2可明显降低癌细胞侵袭能力[23-24]。有研究发现，FOXP2在结直肠癌组织中低表达，与神经浸润、淋巴结转移及不良预后有关，体外过表达FOXP2可显著抑制癌细胞增殖[25]。本研究结果发现，与癌旁组织相比，脑膜瘤组织FOXP2 mRNA表达水平及蛋白阳性表达率明显降低，且FOXP2蛋白低表达与脑膜瘤WHO分级升高、术前脑干发生水肿有关，与刘揆亮等[25]结果一致，提示FOXP2低表达可能通过调控脑膜瘤细胞增殖促进脑膜瘤发生发展。FOXP2在乳腺癌中被证实参与肿瘤进展中EMT过程，还与肿瘤细胞G1/S转换及增殖有关[7]，因此推测FOXP2也可能通过参与EMT过程影响调控脑膜瘤进展。有研究报道，乳腺癌组织中FOXP2可能诱导了TGF-β/Smad信号通路参与的EMT过程，导致乳腺癌细胞侵袭和迁移能力增强[25]。本研究中，FOXP2低表达也可能通过影响TGF-β/Smad等EMT上游信号途径激活，促进了脑膜瘤细胞增殖和迁移，参与脑膜瘤进展。本研究还发现，FOXP2蛋白低表达亚组患者5年无瘤生存率明显降低，提示FOXP2低表达可能通过促进肿瘤细胞增殖和迁移，影响肿瘤恶性进展，引起5年无瘤生存率低等不良预后。有研究表明，是否进行放射治疗、肿瘤是否全部切除、WHO Ⅱ级等均可能影响脑膜瘤患者复发、死亡等不良预后发生[26]。本研究结果显示，术前脑干水肿、WHO Ⅱ～Ⅲ级、miR-190低表达、FOXP2低表达是影响脑膜瘤患者不良预后的独立危险因素，提示miR-190与FOXP2可能作为评估脑膜瘤的独立预后标志物，在脑膜瘤治疗过程中应关注miR-190与FOXP2表达情况，以改进治疗措施，改善患者预后。但本研究仅从表达水平层面分析miR-190、FOXP2在脑膜瘤中作用，若要明确相关作用机制，还需进一步进行更深入的实验研究。

综上所述，与癌旁组织相比，脑膜瘤组织中miR-190、FOXP2均呈低表达，二者表达水平与WHO分级及5年无瘤生存率有关，可能作为脑膜瘤生物标志物，在评估脑膜瘤患者预后中有一定价值。但由于本研究样本量较少、研究方法较为基础，具体作用机制尚需进一步研究。