木豆叶提取物对股骨头坏死大鼠血液流变学及骨髓间充质干细胞分化的影响

赵飞，姚忠军，胡炳炎，刘东

股骨头坏死是骨科常见且难治性疾病，30～50岁人群的发病率较高[1]，病情进展速度快，若未及时干预治疗，可在短短几年内发展为股骨塌陷或髋关节继发性骨性关节炎，只能采取髋关节置换术救治，但髋关节置换术费用较高[2]。目前对股骨头坏死发病机制认识尚未清楚，导致其治疗难度大且疗效不明显[3]，既往研究显示，中医治疗股骨头坏死具有一定的疗效且安全性好[4-5]。木豆叶是豆科木豆属植物木豆的茎叶，具有消肿解毒的功效，对股骨头缺血性坏死有显著预防作用[6]。股骨头坏死危险因素较多，包括使用糖皮质激素、系统性红斑狼疮、关节移位及酗酒等[7]。本研究通过构建激素性股骨头坏死大鼠，观察木豆叶提取物对股骨头坏死大鼠血液流变学及骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的影响，为临床木豆叶提取物治疗股骨头坏死提供实验依据，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物： SPF级雄性SD大鼠50只，4周龄，体质量(190±20)g，购于中山大学东校区实验动物中心[SCXK(粤)2016-0029]，SPF级饲养环境常规饲养，培育室温度20～25 ℃，湿度50 %～55 %，进行人工光照(12 h/昼、12 h/夜)，大鼠全天自由饮水。(2)药物与试剂：甲基强的松龙(美国Target Molecule Corp公司)，木豆叶提取物采用通络生骨胶囊，购于浙江海正药业股份有限公司。大肠杆菌脂多糖(美国Sigma公司)，三酰甘油(中国上海朗顿生物科技有限公司)，碱性磷酸酶(ALP)试剂盒、大鼠骨钙素(BGP)ELISA试剂盒(中国上海恒斐生物科技有限公司)。 (3)仪器：冷冻离心机(5702R型，德国Eppendorf公司)，轮盘式切片机(RM2016型，德国LEICA公司)，多功能酶标仪(EnVision型，英国珀金埃尔默公司)，显微镜(LV-150N型，日本NIKON公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠模型制备及干预: 2017年10月—2018年12月于湖北省十堰市太和医院生物医学研究所进行实验。大鼠适应性饲养1周，随机数字表法分为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组10只 ，参考文献[8]将后4组大鼠用于激素性股骨头坏死动物模型制备：大鼠尾静脉注射大肠杆菌脂多糖40 μg/kg，1次/d，连续注射2 d，末次注射后次日予甲基强的松龙20 mg/kg臀肌注射，1次/d，连续注射3 d；对照组大鼠注射等剂量的生理盐水。在建模的同时，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予通络生骨胶囊混悬液0.48、0.96、1.44 g/kg灌胃干预，1次/d，对照组等体积的生理盐水灌胃，均连续干预4周。大鼠股骨头肉眼可见软骨面存在缺损，坏死面显露并且髓腔内存在脂肪堆积等变化[9]，表明模型制备成功。

1.2.2 BMSCs分离培养: 各组大鼠麻醉处死，于无菌条件下分离股骨与胫骨，去除附着肌肉组织，去掉两端干骺端，采用10%PBS、IMDM培养基冲洗骨髓腔至发白，收集洗涤液，无菌网过滤，其中液体培养于6孔板中，37 ℃、5 %CO2培养箱中静置培养，3 d更换1次培养基，当细胞铺满近80%时，进行传代培养，取第3代BMSCs用于分化实验。同时取对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠干预结束后2 h的心脏血3 ml，于4 ℃离心收集上层血清，-20 ℃保存备用。

1.2.3 BMSCs分化干预: 将第3代BMSCs分为空白组、处理组。处理组分为3个亚组，分别为低剂量亚组、中剂量亚组、高剂量亚组，每组6个复孔，重复3次，其中培养基中分别加入1.2.2所述的含药血清，空白组不做药物处理，参考文献[10]中的方法，连续干预1周。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 血液黏度及凝血指标检测：于大鼠给药干预结束后2 h，1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，采取心脏血3 ml置于含有肝素的抗凝管中备测，采用全自动分析仪检测全血黏度、血浆黏度，凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)。

1.3.2 骨组织病理学观察： 药物连续干预4周后，麻醉处死各组大鼠，切开皮肤，分离肌肉组织，暴露关节囊，取出右侧股骨头并置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于苏木精—伊红(HE)染色，进行病理学观察。

1.3.3 TG、ALP、BGP检测：各组含药血清干预结束后，收集BMSCs细胞，1 000 r/min离心10 min，PBS洗涤细胞3次，沉淀细胞并收集，裂解细胞，3 000 r/min离心30 min，收集上清液，按照TG、ALP、BGP试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 钙化结节面积检测：采用硝酸银染色观察各组钙化结节情况，BMSCs分化干预结束后，弃培养液，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定10 min，5%硫代硫酸钠作用30 min，再用蒸馏水漂洗3次，1%硝酸银UV染色30 min，蒸馏水冲洗掉黑色物质，5%硫代硫酸钠作用2 min，1%中性红复染10 min，蒸馏水漂洗，在Polarid DMCⅡ图像分析仪下进行钙化结节面积观察。

2 结 果

2.1 各组血液流变学指标比较 与对照组比较，模型组大鼠全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度、血浆黏度均增加(P<0.01)；与模型组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组均降低(P<0.05)；随着木豆叶浓度增加，低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠血液黏度逐渐降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)，见表1。

2.2 各组凝血功能比较 与对照组比较， 模型组大鼠PT、APTT、TT均降低(P<0.01)；与模型组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组均升高(P<0.05)；随着木豆叶浓度增加，低剂量组、中剂量组、高剂量组凝血时间逐渐增加(P均<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠凝血功能指标比较

注：与对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05

2.3 各组骨组织病理学比较 对照组大鼠股骨头软骨细胞排列有序，骨小梁完整，空骨陷窝较少，未见细胞坏死。模型组大鼠股骨头软骨细胞排列紊乱且肥大，骨小梁变窄，有空骨陷窝，脂肪细胞变大，可见明显坏死细胞。低剂量组、中剂量组及高剂量组大鼠股骨头损伤情况得到改善，其中高剂量组大鼠股骨头改善状况更明显，见图1。

2.4 BMSCs分化比较 与空白组比较，处理组(低剂量亚组、中剂量亚组、高剂量亚组)的BGP水平、钙化结节面积及ALP活性升高，TG水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；随着木豆叶含药血清浓度增加， BGP水平、钙化结节面积及ALP活性也逐渐升高，TG水平逐渐降低(P<0.05)，见表3。

3 讨 论

股骨头坏死属于退行性、破坏性骨病，其病程时间长且致残率较高，严重影响患者日常生活。目前对股骨头坏死的发病机制尚未明确，但普遍接受血管内凝血学说、脂代谢紊乱学说、细胞凋亡学说及激素毒性作用等，尽管各种学说的侧重点不一，但最终都会影响骨微循环[10]。本研究结果发现，与对照组大鼠比较，激素性股骨头坏死大鼠全血黏度呈现出升高状态，而PT、APTT、TT降低，由此表明激素性股骨头坏死大鼠体内表现出高凝状态。高凝状态、高游离脂肪酸会加快血管内皮损伤，使血管局部凝血加重，促使软骨下微循环障碍、血栓形成，升高骨内压、减少血流量，引起缺血缺氧，最终形成股骨头坏死[11-12]。本研究发现通过木豆叶提取物干预后可以明显降低激素性股骨头坏死大鼠全血黏度，并且还可以延长PT、APTT、TT时间，可能是因为木豆叶本身具有消肿止痛、活血化瘀等作用，改善激素性股骨头坏死大鼠的血循环状态，从而改善激素性股骨头坏死大鼠高凝状态。

表1 各组大鼠血液流变学指标比较

注：与对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05

表3 各组大鼠BMSCs分化情况比较

组 别nBGP(μg/L)钙化结节面积(mm2)TG(μg/ml)ALP(U/ml)空白组6214.31±13.2532.11±3.042.89±0.21129.62±8.64处理组 低剂量亚组6233.67±12.34 36.25±2.65 2.11±0.23 141.65±9.44 中剂量亚组6250.41±13.36 40.21±3.44 1.83±0.16 155.99±9.62 高剂量亚组6269.84±14.32 45.83±3.69 1.52±0.14 168.27±9.03 F/P值18.914/0.00019.659/0.00058.108/0.00020.140/0.000

经过对激素性股骨头坏死大鼠股骨头病理检查发现染色，股骨头表现出坏死、骨小梁空骨陷窝、骨细胞坏死、脂肪细胞增大等病理症状，而经过木豆叶提取物干预处理可以改善上述病理症状，并且随着作用浓度的增加改善程度越明显。有研究显示[13]，由木豆叶单味药组成的通络生骨胶囊可以促进新西兰兔激素性股骨头坏死修复，减少股骨头坏死的发生率，本研究结果也支持其观点。中医认为气血在股骨滋养、骨质正常形态及其功能的维持中具有重要作用，木豆叶不仅具有活血化瘀的功效，还具有抗炎、抗肿瘤、降血脂、抗骨质疏松等作用，化学成分主要有黄酮类、芪类、豆甾醇、儿茶酚、水杨酸等[14-15]，其中木豆叶芪类通过影响胆固醇逆向转运实现对胆固醇代谢的调节作用及血管保护作用，木豆叶黄酮类还可以促进新生骨钙的沉积及磷含量，增强对股骨头坏死部分的修复作用，此外，木豆叶中还含有豆甾醇、儿茶酚、水杨酸等物质，但能否对激素性股骨头坏死有改善作用，还需要进一步研究。由此表明，木豆叶提取物对激素性股骨头坏死有改善作用，推测可能与影响骨钙沉积或BMSCs分化有关。

本研究通过激素性股骨头坏死大鼠模型制备BMSCs，经含木豆叶提取物血清干预后，BMSCs中TG水平减低，而ALP活力、骨钙素水平、钙化结节面积明显升高。BMSCs起源于骨髓成体干细胞，具有增殖、多向分化功能，经不同诱导因素刺激可以分化成神经细胞、肝细胞、软骨细胞、成骨细胞等[16]。BMSCs具有向成骨分化、成脂分化的能力，脂肪细胞主要特点为合成并存储TG，所以TG可以反映BMSCs成脂分化情况。ALP是BMSCs向成骨细胞分化的早期重要指标，ALP活性也直接反映BMSCs向成骨细胞分化的能力。BMSCs向成骨细胞分化的最终表现为钙化，钙化结节可以反映最终钙化情况。刘长河等[17]研究显示，木豆叶提取物可以较好改善维甲酸诱导的大鼠骨质疏松，增加股骨、椎骨的骨钙水平。本研究结果也发现，大量激素作用可以促进BMSCs脂肪代谢紊乱、分化异常，血液的黏稠度增加，血脂水平异常升高，血栓形成引起栓塞，导致股骨头供血不足，从而引起骨细胞坏死。木豆叶提取物对BMSCs成骨分化有促进作用，可能是提高了BMSCs的应激性及自我保护，抑制BMSCs凋亡，还有可能是通过影响MAPK途径[18]，但其中的具体作用机制还需要进一步研究。

综上所述，木豆叶提取物对激素性股骨头坏死大鼠的血液黏度、凝血功能有一定的改善作用，可能通过增强BMSCs向成骨分化能力，促进激素性股骨头坏死大鼠股骨头坏死修复。