表达山羊SLAM 受体的重组腺病毒的构建及在增强PPRV 感染羊源原代细胞中的应用

陈合凤，张 帅，王喜军，王金良，温志远，葛金英，陈伟业*，步志高,2*

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069；2.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009）

小反刍兽疫（Peste des petits ruminants，PPR）是一种由PPR 病毒（PPRV）引起的急性、高度接触性传染病。PPRV 主要感染小反刍兽，如绵羊和山羊，其中山羊比绵羊更容易感染该病毒[1]，新生和幼小动物比成年动物更易受到其影响。OIE 将PPR列为必须通报的动物疫病，在我国被列为一类动物传染病。该病于1942 年在非洲的科特迪瓦首次报告，目前该病主要发生在非洲（最南部国家除外）、阿拉伯半岛、中亚和中东、东亚以及东南亚等地。PPR 于2007 年在我国西藏地区发生，这也是中国境内首次暴发PPR 疫情。2013 年底，我国再次暴发该疫情，2014 年PPR 在我国22 个省、自治区、直辖市出现，造成了重大经济损失。2015 年，为有效保障养羊业稳定发展，中国农业部制定了《全国小反刍兽疫消灭计划（2016-2020 年）》。

腺病毒载体（Adenovirus，Ad）由于安全性高、宿主范围广泛、病毒颗粒相对稳定等优点，已成为最常用的病毒载体之一[2]。尤其是5 型腺病毒载体（Ad-5），由于其E1 区缺失造成病毒复制缺陷，不会引起宿主损伤，已广泛应用于如狂犬病病毒、流感病毒、埃博拉病毒等诸多病毒以及寄生虫疫苗的研究，并获得良好免疫效果[3]。现已鉴定的PPRV 受体有信号淋巴细胞激活分子（Signalling lymphocyte ac⁃tivation molecule，SLAM）[4]和脊髓灰质炎病毒受体4（Nectin4）[5]。SLAM 也称作CD150，它是多种麻疹病毒属病毒的细胞受体，麻疹病毒属病毒的H 蛋白通过与SLAM 结合开启其感染过程，CD150 主要在淋巴细胞、巨噬细胞及树突状细胞等细胞中表达。有学者构建了表达犬SLAM 受体的Vero 细胞系，野生型犬瘟热病毒能够在该细胞系中良好生长并且该细胞系可稳定表达SLAM 受体，并可以增强PPRV 的感染与复制[6-7]。吴锦艳等利用慢病毒介导技术将山羊SLAM 基因整合到Vero 细胞中获得了稳定表达SLAM的Vero 细胞系，与野生型Vero 细胞相比，病毒在该细胞系中的病变周期明显缩短[8]。

相关研究中，主要利用Vero 细胞分离和培养PPRV，但利用羊源细胞作为分离培养PPRV 的细胞及研究模型，则更利于PPRV 复制及其与宿主细胞相互作用的研究。然而目前羊源细胞系非常稀少，且没有一种适用于PPRV 的有效分离与培养。羔羊原代肾细胞和肺脏细胞等可用于PPRV 的分离，但通常需要盲传数代，且其敏感性不高，降低了PPRV 的分离效率，制约了其与宿主细胞相互作用的研究。如果羊原代细胞能够表达SLAM 受体，则会提高其对病毒的易感性，且更适合用于PPRV 的分离培养及其它研究。由于稳定表达SLAM 的原代细胞系不易制备，因此只能通过构建表达其受体的腺病毒载体等手段来感染细胞，从而实现受体在细胞中的表达。

基于此，本研究构建表达山羊SLAM（Goat SLAM，gSLAM）的重组腺病毒，将其感染羊源原代细胞并表达gSLAM 受体，以提高该细胞对PPRV 的易感性，为PPRV 的分离培养及与宿主细胞相互作用等研究提供重要的研究工具。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒和病毒Vero 细胞、293A 细胞、pShuttle-CMV 质粒、不带外源基因的腺病毒Ad、pIRES3-gSLAM 质粒[9]、原代羔羊睾丸细胞（Lamb testicular，LT）、表达绿色荧光蛋白的重组rPPRV/GFP[7]，其亲本病毒为PPRV Nigeria75/1 疫苗株，由本实验室保存、制备或构建；PPR 中国流行株PPRV/CN/HLJ/13 是在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家动物疫病防控高级别生物安全实验室生物安全三级防护条件下分离和保存。

1.2 主要试剂Phanta Max Super-Fidelity DNA 聚合酶、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit、AceQ®U+ Probe Master Mix、DH5α 感受态细胞均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；各种限制性内切酶购自NEB 公司；大肠杆菌BJ5183 感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限公司；Lipofectamine 3000 转染试剂盒购自Invitro⁃gen 公司；质粒大提试剂盒购自天根生化（北京）科技有限公司；Flag 单克隆抗体（MAb）、HRP 标记的山羊抗鼠IgG（IgG-HRP）购自Thermo 公司；增强型化学发光显影试剂购自默克公司。

1.3 引物的设计与合成根据pIRES3-gSLAM 质粒序列设计引物gSLAM-F：CTAGAGATCTGGTACCGT CGACGCCGCCACCATGGACCACAAG/gSLAM-R：GCT TTAACAGAGAGAAGTTCGTGGCGCCGCTTCCCTTGTC GTCGTCGTCCTTGTAGACGGACTCGGGCAC，用于扩增目的基因gSLAM。根据GenBank 登录的mCherry 基因（MF169983.1）合成mCherry 基因，并设计引物mCherry-F：GCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAG CAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCCATGGTGA GCAAGGGCGAG/mCherry- R： AGGCTCGAGCGGCCG CGTCGACCTACTTGTACAGCTCGTCCATG（斜体部分为Sal I 酶切位点），用于扩增mCherry 目的基因片段。根据pShuttle-CMV 质粒序列设计引物JD-F：CTAGAGATCTGGTACCGTC/JD-R：AGGCTCGAGCGG CCGCGTC，用于鉴定重组腺病毒。引物和基因均由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.4 重组腺病毒载体pAd-gSLAM-mCherry 的构建与鉴定以pIRES3-gSLAM 质粒为模板，利用gSLAM-F/R 引物PCR 扩增gSLAM 片段；以合成的mCherry 基因为模板，利用mCherry-F/R 引物PCR 扩增mCherry 片段。pShuttle-CMV 质粒经Sal I 酶切，PCR 产物gSLAM 和酶切产物mCherry 纯化回收后，利用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit 将上述两个片段克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV（约7.5 kb），经测序鉴定得到正确的重组穿梭载体pShuttlegSLAM-mCherry。将该载体经Pme I 线性化后，转化至含有pAdEasy-1 的BJ5183 感受态细胞中进行同源重组，在卡那霉素抗性的培养基上筛选，挑取单克隆，用Pac I 酶切鉴定后，得到重组腺病毒载体，命名为pAd-gSLAM-mCherry。

1.5 重组腺病毒rAd-gSLAM 的包装、鉴定利用Lipofectamine 3000 转染试剂将2.5 μg Pac I 酶切线性化的质粒pAd-gSLAM-mCherry 转染293A 细胞，转染后7 d 利用荧光显微镜观察，待细胞出现细胞病变（CPE）时收集细胞，反复冻融并剧烈震荡细胞3 次后提取细胞总DNA，利用鉴定引物JD-F/R 经PCR 鉴定后获得的重组腺病毒命名为rAD-gSLAM。将收集到的病毒液再感染293A 细胞并传代，取第3 代病毒滴定后用于后续试验。

1.6 重组腺病毒感染Vero 细胞后外源基因表达的检测以第3 代rAd-gSLAM（MOI 3）感染6 孔细胞培养板中密度约为90%的Vero 细胞，分别于感染后24 h 和120 h 在倒置荧光显微镜下观察。感染48 h 后收获细胞（Vero/rAd-gSLAM）及上清，经SDS-PAGE后以Flag MAb（1∶1 000）为一抗， 山羊抗鼠IgGHRP（1∶2 000）为二抗，采用western blot 鉴定gSLAM蛋白的表达，设正常Vero 细胞和感染Ad 的Vero 细胞（Vero/Ad）为对照。

1.7 PPRV 在感染rAd-gSLAM 的Vero 细胞中复制能力的检测及生长曲线的测定将rAd-gSLAM 以MOI 3 感染12 孔细胞培养板中密度约90%的Vero 细胞，设正常Vero 细胞和感染Ad 的Vero 细胞为对照，24 h 后分别感染rPPRV/GFP 和PPRV/CN/HLJ/13，48 h 后在倒置荧光显微镜下观察。分别于感染后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 收获细胞及上清，反复冻融3 次后提取RNA 反转录为cDNA 后做模板，经qPCR 检测PPRV N 基因的拷贝数[7]，分别根据拷贝数绘制rPPRV/GFP 和PPRV/CN/HLJ/13 的生长曲线。分别设Vero/Ad 和正常的Vero 细胞作对照。针对PPRV Nigeria75/1 株（X74443）和PPRV/CN/HLJ/13 株N 基因（本实验室测序）设计qP⁃CR 探针及引物：探针N13-75-probe：FAM-5'-CA AGTATGAGAGATACCATGAACCGCCG-3'-Tamra， 引物为N13-75-f：5'-AACTGAGAAGGTGGGTTAAATAC AC-3'/N13-75-r：5'-ACAATATAGTTGTCAATGTCGC AGA-3'。反应体系及反应程序按照AceQ®U+ Probe Master Mix 说明书操作。利用Excel 软件进行统计学分析，组间比较采用t 检验，p＜0.05 差异显著，有统计学意义。

1.8 PPRV 在感染rAd-gSLAM 的原代LT 细胞中复制能力的检测将rAd-gSLAM 以MOI 3 感染原代LT细胞，设正常LT 细胞和感染Ad 的原代LT 细胞为对照，24 h 后以MOI 0.1 分别感染rPPRV/GFP 和PPRV/CN/HLJ/13，72 h 后，在倒置荧光显微镜下观察不同细胞的感染情况。

2 结 果

2.1 重组腺病毒载体pAd-gSLAM-mCherry 和重组腺病毒rAd-gSLAM 的鉴定经测序鉴定结果显示重组穿梭质粒pShuttle-gSLAM-mCherry 正确构建。Pme I 线性化的重组穿梭载体pShuttle-gLAM-mCher⁃ry 与BJ5183 细菌中的腺病毒骨架质粒pAdEasy-1 同源重组，得到重组腺病毒载体pAd-gSLAM-mCher⁃ry，经Pac I 酶切后得到约30 kb 和4.5 kb 大小的片段，表明重组腺病毒载体正确构建（结果未显示）。将重组腺病毒载体转染293A 细胞，7 d 后经荧光显微镜观察到红色荧光。待细胞出现CPE 后，提取DNA，经PCR 鉴定可扩增出约1 800 bp 大小的条带，与预期相符（图略），表明获得了携带外源基因gSLAM 的重组腺病毒rAd-gSLAM。

2.2 重组腺病毒感染细胞及外源基因表达的检测结果第3 代rAd-gSLAM 经测定，其效价可达108.2TCID50/mL。将其以MOI 3 感染Vero 细胞后24 h，经荧光显微镜观察约95%以上细胞出现红色荧光，感染120 h 后细胞仍然有红色荧光但一直无CPE（图1A），表明rAd-gSLAM 能够感染Vero 细胞但不产生CPE。收获感染48 h 的细胞经western blot 鉴定。结果显示，在约55 ku 附近出现特异性条带，与预期相符（图1B）。以上结果表明该重组腺病毒感染细胞后能够表达gSLAM 蛋白。

2.3 PPRV 在 感染rAd-gSLAM 的Vero 细 胞 中复 制能力的检测结果将rAd-gSLAM 以MOI 3 感染Vero细胞24 h 后分别感染rPPRV/GFP、PPRV/CN/HLJ/13，48 h 后经荧光显微镜观察可见，rPPRV/GFP 感染的Vero/rAd-gSLAM 细胞可观察到较大量绿色荧光且形成明显的细胞融合，而其感染的Vero、Vero/Ad细胞可观察到较少量绿色荧光且无明显细胞融合（图2）；PPRV/CN/HLJ/13感染的Vero/rAd-gSLAM细胞中形成明显的细胞融合且出现红色荧光，而该病毒感染的Vero 细胞和Vero/Ad 细胞则无细胞融合（图2）。表明感染rAd-gSLAM 的Vero 细胞表达SLAM受体后利于PPRV 的感染和复制。

2.4 PPRV 在 感染rAd-gSLAM 的Vero 细 胞 中生 长曲线的测定rPPRV/GFP、PPRV/CN/HLJ/13 感染Ve⁃ro/rAd-gSLAM 细胞后不同时间经qPCR 检测PPRV N基因拷贝数，根据Excel 绘制的生长曲线结果显示，rPPRV/GFP 在Vero/rAd-gSLAM 细胞中的拷贝数与其在Vero 和Vero/Ad 对照细胞中的拷贝数在感染后各时间点差异均不显著（p＞0.05）（图3A）；PPRV/CN/HLJ/13 在感染Vero/rAd-gSLAM 细胞后24 h 的拷贝数即达到高峰，随后下降，在72 h 最低，再小幅度上升；而其感染Vero 及Vero/Ad 细胞后的拷贝数分别在72 h 和96 h 达到高峰，且PPRV/CN/HLJ/13 在Vero/rAd-gSLAM 细胞中的拷贝数与其在Vero 和Vero/Ad 对照细胞中的拷贝数差异均显著（p＜0.05）；其感染Vero/rAd-gSLAM 细胞后72 h 的拷贝数仍约为其感染Vero 及Vero/Ad 细胞的48 倍（图3B）。结果表明gSLAM 的表达对PPRV/CN/HLJ/13 在Vero 细胞中的复制有明显增强作用，但对rPPRV/GFP 的复制无明显增强作用。

图1 rAd-gSLAM 感染Vero 细胞后gSLAM 蛋白表达的鉴定结果Fig. 1 Identification of gSLAM protein expression in Vero cells infected with rAd-gSLAM

2.5 PPRV 在感染rAd-gSLAM 的LT 细胞中复制能力的检测结果将rAd-gSLAM 感染LT 细胞后24 h，再感染rPPRV/GFP，72 h 后利用荧光显微镜观察可见绿色荧光，且有明显的细胞融合，而正常LT 细胞和LT/Ad 细胞在感染rPPRV/GFP 后无明显的细胞融合出现，且仅可见零星细胞出现绿色荧光；PPRV/CN/HLJ/13 感染rAd-gSLAM 预先感染的LT 细胞72 h可见明显的细胞融合和CPE（图4，箭头所指为细胞融合和CPE），而正常LT 细胞和LT/Ad 细胞感染该病毒后均未出现细胞融合和CPE。表明rAd-gSLAM感染LT 细胞后表达了gSLAM 受体，且PPRV 可以在表达gSLAM 的羊源原代细胞中感染和复制。

图2 rAd-gSLAM 感染Vero 后对PPRV 感染和复制影响的检测结果Fig. 2 Detection of the PPRV infection and replication in Vero cells after rAd-gSLAM infection

图3 rPPRV/GFP（A）和PPRV/CN/HLJ/13（B）在Vero/rAd-gSLAM 中的生长曲线Fig. 3 Growth curve of rPPRV/GFP (A) and PPRV/CN/HLJ/13(B) in Vero/rAd-gSLAM

图4 PPRV 在感染rAd-gSLAM 的LT 细胞中复制的鉴定结果Fig. 4 Observation of PPRV replication in LT cells infected with rAd-gSLAM

3 讨 论

SLAM 为PPRV 的主要受体，对该受体展开研究对PPRV 感染机制的阐明意义重大。之前有报道通过构建表达犬SLAM 的Vero 细胞系来提高PPRV 的感染和复制能力，但筛选单克隆细胞的过程比较繁琐，耗时较长（2 个月以上），且该方法不适用于原代细胞[6]。吴锦艳等利用重组慢病毒表达系统构建的Vero/SLAM 细胞具有明显增强PPRV 复制的功能，但该研究的目的也是构建细胞系，不适用于原代细胞[8]。重组慢病毒瞬时感染也可以在原代细胞中表达受体，但慢病毒感染谱比腺病毒窄，表达效率不如腺病毒，且慢病毒包装繁琐而不易制备，病毒滴度低，更适用于构建稳定表达外源基因的细胞系，而在原代细胞中瞬时表达病毒受体，腺病毒则更有优势。本研究构建的表达gSLAM 的重组腺病毒rAd-gSLAM 属于5 型复制缺陷型Ad，3周左右就能完成其构建，并避免了构建表达受体的不同细胞系的繁琐步骤，同时还具备适用于原代细胞、感染率高、对感染细胞无影响、成本低、易于制备等优点。本实验构建的重组腺病毒滴度能达到109TCID50/mL，不用浓缩纯化即能获得较高滴度的重组病毒，感染细胞后，可以使95%以上的细胞感染并表达gSLAM 受体。但腺病毒感染不同细胞存在不均一现象，导致不同细胞表达的受体量不同而对PPRV 感染均一性产生影响，在均一性上不如表达受体的细胞系[10]。

Vero 细胞、原代羔羊肾细胞和肺脏细胞等作为OIE 推荐的分离PPRV 的细胞，一般需要盲传几代，表明这几种细胞对PPRV 的易感性较差，而且在传代中病毒容易突变。而本研究结果表明，Vero 细胞感染rAd-gSLAM 后均可以提高PPRV 流行株的感染和复制能力，且感染后的Vero 细胞出现明显融合现象，并且较大幅度提高了该株病毒的复制水平。但感染rAd-gSLAM 后的Vero 细胞对rPPRV/GFP 复制的增强作用不明显，主要原因是由于该疫苗株就是PPRV 强毒株在Vero 细胞中适应100 多代次获得的[11]，其已经完全适应了Vero 细胞。流行株PPRV/CN/HLJ/13 感染Vero/rAd-gSLAM 细胞后，24 h 病毒拷贝数就能够达到高峰，大幅度提高了该病毒的复制能力。同样，感染rAd-gSLAM 后的原代LT 细胞，同样也提高了PPRV 疫苗株和流行株的感染和复制能力，且LT 作为羊源细胞，更适用于PPRV 临床样品的分离与鉴定。由于原代LT 细胞不是PPRV的敏感细胞，本实验仅经显微镜就能观察到PPRV感染gSLAM 受体表达的LT 细胞与感染未表达该受体LT 细胞的明显不同，因此未采用荧光定量PCR检测病毒拷贝数。

综上，本研究构建了表达gSLAM 的重组腺病毒，为PPRV 在羊源细胞中的生长、复制提供了重要的工具，为PPRV 在本动物体外感染与免疫机制的研究奠定了重要基础。