猪附红细胞体eno 基因可视化LAMP 检测方法的建立与应用

金丽兰，付兢锋，马浩原，王静璇，李长春，薛书江，高 旭*

（1.延边大学农学院动物医学系，吉林 延吉 133000；2.敦化市农业综合行政执法大队，吉林 敦化 133700）

猪附红细胞体病（Porcine eperythrozoonosis，PE）是由猪附红细胞体（Mycoplasma suis，M. suis）寄生于猪红细胞表面，引起一种以溶血性贫血、黄疸和发热为主要临床症状的人畜共患传染病[1]。M. suis 宿主范围较广，除猪外，人、犬、猫、牛等动物均可感染，多呈隐性感染[2]。M. suis 寄生于宿主红细胞表面使其变形和衰亡，导致机体贫血和免疫力下降，易引起其它病原体继发感染，使病情加重和死亡率升高，严重制约了养猪业的健康发展[1-2]。截至目前，PE 无有效的治疗药物，一旦发病只能采取综合治疗方法延缓病程，幸存患病猪通常长期携带病原体，并持续向外排毒，这是该病预防与病原体净化的难题。因此，建立一种快捷、简便、特异和灵敏的早期检测诊断方法显得尤为重要。

目前，常用于PE 的检测方法有吉姆萨染色、ELISA、间接免疫荧光试验（IFA）、PCR 和荧光定量PCR 等方法，但吉姆萨染色法存在着检测结果不准确，ELISA 和IFA 不能用于早期诊断，以及PCR 和荧光定量PCR 需要昂贵专业仪器等缺点，而不能在基层推广应用，使PE 的早期临床诊断受到影响[3-4]。环介导等温扩增技术（Loop-mediated isother⁃mal amplification method，LAMP）与其它分子检测技术相比，不仅敏感性高，操作简便，而且不需要专业仪器，可用肉眼直接判读结果，养殖户可以自行操作检测，便于基层养殖户的实地推广应用。由于M. suis 的归属与定性较晚，以及全基因组刚被测通[5]，至今仅见李月梅等[6]以M. suis 的16S rRNA 为目的基因建立了LAMP 检测方法，但由于所检测基因为16S rRNA，非病原体结构基因，使该方法存在一定局限。因此，本研究拟以M. suis 的结构基因α-烯醇化酶（eno）基因为目的基因，在保守区设计4 条特异性引物，通过对反应条件、反应程序的优化与筛选，建立一种快捷、简便、特异、敏感和易于推广的LAMP 方法，为PE 的早期诊断和病原体净化提供一种有效的检测手段。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料弓形虫、大肠杆菌、猪链球菌I 型、牛源瑟氏泰勒虫和M. suis 及其阳性猪血液样品均由延边大学预防兽医学实验室保存。MgSO4（100 mmol/L）、EX Taq DNA 聚合酶、Bst DNA 聚合酶、10×ThemoPol Buffer、dNTP Mix（10 mmol/L）均购自NEB 公司；10 000×SYBR GreenⅠ染料购自北京索莱宝生物技术有限公司；E.Z.N.A.基因组提取试剂盒、E.Z.N.A. Bacterial DNA Kit、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自Omega 公司；pMD18-T simple vector、DL2000 DNA Marker 购自宝生物工程（大连）有限公司。84 份临床疑似感染M. suis 的猪血液检测样品采自延边州5 家猪养殖场。

1.2 LAMP 引物设计根据GenBank 中登录的M.suis基因组（NC_015153），应用Oligo6.0 软件在eno 基因的保守区内设计1 对特异性引物，P1：GGATCCAT GGCTTTTAGTATAGAAAATC/P2：CTCGAGTTCTGATA GACATCCAGCTTTA，分别含有BamH I 和Xho I 酶切位点，预期克隆目的片段大小为864 bp；应用prim⁃er explorer V5 软件，在上述eno 基因保守区内设计4条特异引物，外引物为F3 和B3，即F3：GGGAA AATTCCTAAGTAAGAAGA/B3：AGAACTTGACAGATT CTTAATGG；内引物为FIP 和BIP，即FIP：CAGCT AAGGTATTAGTTCCCTC/BIP：GGAGTTAAGAAAGCTG TTCACTACA。引物由英潍捷基贸易有限公司合成。

1.3eno的扩增与TA 克隆采用E.Z.N.A.基因组提取试剂盒提取本实验室保存的M. suis 基因组DNA 为模板，以P1/P2 为引物，进行eno 基因扩增，退火温度为55 ℃，PCR 产物经1%琼脂糖电泳检测后回收目的基因，进一步进行TA 克隆、酶切和测序，将酶切与测序正确的质粒命名为pMD-eno。

1.4 LAMP 的反应条件优化与可视化检测以测序正确的质粒pMD-eno 为模板，LAMP 检测方法的基础，反应体系为：总体积为25 μL，质粒F3/B3各取0.5 μL，FIP/BIP 各取4 μL，dNTPs（1.4 mmol/L）取3.5 μL，Mg2+1.5 μL（100 mmol/L），BstDNA Poly⁃merase 1 μL（320 U/mL），10×ThermoPol Buffer 2.5 μL，模板2 μL，用ddH2O 补至25 μL。反应条件：63 ℃，50 min，结束后80 ℃，2 min 终止反应后进行电泳观察。

基于以上LAMP 反应体系，利用方阵法进行退火温度（57 ℃、59 ℃、61 ℃、63 ℃和65 ℃）、反应时间（30 min、40 min、50 min和60 min）、内外引物浓度比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8 和1∶10）和镁离子浓度（1 mmol/L、2mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L、10 mmol/L）的筛选，确定最优的反应条件。同时，以最优条件进行试验，在反应结束后加入SYBR Green I 染料，观察反应体系是否发生有效颜色变化。

1.5 特异性试验利用E.Z.N.A.基因组提取试剂盒和E.Z.N.A. Bacteral DNA Kit 分别提取弓形虫、大肠杆菌、猪链球菌I 型、牛源瑟氏泰勒虫和M.suis 的基因组作为模板，利用上述建立的LAMP 方法检测，进行特异性试验，同时设立ddH2O 空白对照。

1.6 敏感性试验将重组质粒pMO-eno 进行10 倍倍比稀释（100～107倍）后作为模板，即8 个梯度浓度（3×107拷贝/μL～3 拷贝/μL），同时设立空白对照，按照建立的LAMP 检测方法进行敏感性试验。同时用1.3 中PCR 方法检测，对两种方法检测结果进行对比分析。

1.7 重复性试验取同一时间提取M.suis基因组进行10 倍倍比稀释（10-1～10-6）后，应用本研究已建立的LAMP 试验方法检测，进行组内重复试验；取6个不同时间提取的M.suis基因组进行10 倍倍比稀释后，应用本研究已建立的LAMP 试验方法检测，进行组间重复试验。均设立ddH2O 阴性对照组。

1.8 临床应用试验应用本研究建立的LAMP 方法和1.3 中PCR 方法，对延边州84 份疑似感染M.suis的猪血液检测样品进行检测，同时设2 份镜检和PCR 检测M.suis 阳性样品做阳性对照，对实验结果进行分析。

2 结 果

2.1 LAMP 方法的建立以重组质粒pMO-eno 为模板，利用方阵法优化LAMP 检测方法，结果显示，当反应60 min，反应温度为63 ℃时，梯状条带最清晰（图1A）。以63 ℃为最优反应温度进行LAMP 试验反应，结果显示在设立的时间梯度中50 min 为最优反应时间（图1B）。以63 ℃为反应温度，50 min 为反应时间，进行LAMP 试验，结果显示在设立的镁离子浓度6 个梯度中，6 mmol/L 为最佳反应浓度（图1C）。以M.suis基因组DNA 为目的基因，将外引物F3/B3 均设为0.2 μmol/L，设立外引物与内引物浓度比梯度，进行LAMP 试验。结果显示，当外内引物浓度比为1∶6 时（图1D），反应梯度条带最清楚，即为最佳引物浓度比。

图1 LAMP 反应温度（A）、反应时间（B）、Mg2+浓度（C）和引物浓度比（D）筛选结果Fig. 1 LAMP test results under different temperature(A), time(B), Mg2+ concentration(C), primer concentration ratio(D) screening

2.2 LAMP 可视化检测在应用建立的LAMP 试验反应后，向试管里加入SYBR Green I 染料，在紫外灯下可见到阳性组呈现绿色荧光，而阴性组呈现橙色（图2），表明本研究建立的LAMP 方法可以用肉眼直观判读结果。

2.3 特异性试验分别以双蒸水，以及弓形虫、大肠杆菌、猪链球菌I 型、牛源瑟氏泰勒虫和M. suis的基因组为模板，进行LAMP 检测。结果显示，仅M.suis出现荧光，ddH2O 空白对照和其它4 个病原体组均无荧光（图3），即为阴性反应，表明本研究建立的LAMP 检测方法具备良好的特异性。

图2 LAMP 可视化结果Fig. 2 Visualization results of LAMP

图3 LAMP 特异性试验结果Fig. 3 Results of LAMP specificity test

2.4 敏感性试验将提取的重组质粒pMO-eno 按照10 倍倍比稀释成8 个梯度（100～107），按照本试验建立的LAMP 检测方法进行试验。结果显示，其最低检测稀释倍数可达到106倍（30 拷贝/μL）（图4），而普通PCR 检测方法仅能检测到104倍。以上结果表明，本研究建立的LAMP 检测方法具有较好的敏感性，比普通PCR 检测方法敏感度高100 倍。

图4 LAMP 敏感性试验结果Fig. 4 Results of LAMP sensitivity test

2.5 重复性试验应用已建立的LAMP 试验方法，进行组内与组间重复试验。结果显示，各反应管均呈现绿色荧光，均为阳性。表明本研究建立的LAMP 检测方法具有良好的重复性。

2.6 临床应用结果对84 份疑似感染M. suis 猪血液样品、2份M.suis阳性猪血液样品进行LAMP和PCR检测。结果显示，2 份阳性样品LAMP 检测为阳性，而84份猪血液样品中，LAMP 检测出34份为阳性，阳性率为40%，其与平行PCR 检测结果相符。表明本研究建立的LAMP检测方法能够进行临床应用。

3 讨 论

2007 年，陈金山等在对河南省的几个猪场进行了流行病学调查，发现其发病率为46.33%，死亡率达13.88%[7]。该病死亡率不高，但由于引起继发感染，使感染猪死亡率升高，对仔猪的危害更为惨重。近期研究发现，Julia 等在德国南部的21 个农场进行PE 调查发现，M. suis 可以垂直传播，初乳摄入前仔猪经垂直传播的感染率达14.35%[8]。这些发现进一步验证了PE 流行的严重现状，以及切断垂直传播的重要性。而且由于PE 是人兽共患传染病，通过血吸虫媒介传播，对人类健康也造成了极为严重的安全隐患，这使预防PE 传播与蔓延，切断和净化M. suis 成为目前研究的热点和难点。

防控PE 的发生与传播，早期发现和确诊是关键。2010 年本研究组成员李月梅等以M. suis 的16S rRNA 为目的基因建立了LAMP 检测方法，由于该方法选用16S rRNA 为目的基因，在提取与扩增过程中受到其它相似病原体的影响较大，导致所建立的LAMP 方法存在一定局限性[6]。因此，以M. suis 的结构基因为目的基因，建立用于M. suis 诊断的LAMP检测方法已是当务之急。然而，一直以来关于M. suis 的研究较少，对于附红细胞体的分类一直存在争议，以至于一定时间内对附红细胞体是否真正存在仍质疑，直至2011 年M. suis 的基因组被测通，最终证实了附红细胞存在，并将其划归为支原体[9]，随后相关结构基因和结构蛋白被测通与证实，其中α-烯醇化酶基因（eno 基因）编码的α-烯醇化酶，是M. suis 粘附宿主细胞的主要功能蛋白，在M. suis 入侵宿主和粘附细胞过程中起重要作用，并具有很好的免疫原性[10]，常用作血清学诊断的目的蛋白，而eno 基因由于其相对保守，常用作分子诊断的目的基因[9,11-13]。截止目前，未见有关于以M.suis 的结构基因建立的LAMP 检测方法的报导，本研究建立的M. suis 可视化LAMP 检测方法，由于其以M. suis 的结构基因作为检测基因，使检测结果更为准确可信。经一系列试验验证，本研究建立的LAMP 方法具有特异、便捷、操作简单、不需要专业仪器和专业技术等特点，可用于基层养殖户自己操作，便于随时采样、随时诊断和随时治疗与防控。与常规PCR 方法相比，其所需时间缩短，特异性强，成本低廉，操作简单，通过水浴锅加热即可实现核酸的扩增，不需要电泳，仅通过加入SYBR Green I染料即可通过紫外灯用肉眼判断结果。其敏感度是普通PCR 的100 倍，检测下限达30 拷贝/μL，与高旭等建立的M. suis TaqMan 荧光定量PCR 检测方法敏感性一致[2]。经对84 份疑似感染M. suis 猪血液样品、2份M.suis阳性样品进行LAMP 和PCR 检测，证明本研究建立的LAMP 可用于临床或实地检测，可及时调查猪场中M. suis 感染情况，可以在感染的早期阶段识别出携带病毒的仔猪，以便淘汰感染母猪，为控制疫情和净化M. suis 将起到积极作用。

本研究建立的LAMP 方法是一种新型、廉价、灵敏、特异且快速的M.suis 检测手段，临床应用与常规PCR 检测结果相一致，LAMP 不需要严格的反应条件、复杂的技术操作和专用设备，为养殖场M.suis 净化提供了快速、便捷的分子诊断方法。