山羊支原体山羊亚种TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

林裕胜，江锦秀，张靖鹏，游 伟，胡奇林

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建 福州 350013）

山羊支原体山羊亚种（Mycoplasma capricolum sub⁃sp. capricolum，Mcc）是引起小反刍动物关节炎、乳腺炎、角膜炎、败血症和呼吸道疾病的病原，同时也是引起传染性无乳症（Contagious agalactia，CA）的主要病原之一[1]。Mcc 能够感染山羊、绵羊、牛、骆驼和人，感染往往是慢性的，且抗生素治疗效果很差[2-3]。在法国[4]、意大利[5]、丹麦[3]、美国[6]等均有Mcc 感染的报道，成年羊的发病率为0～20%，哺乳母羊的发病率为3%～50%，青年羊的发病率为10%～98%，成年羊的病死率为3%～40%，哺乳母羊的病死率为10%～80%，青年羊的病死率为20%～98%[4]。储岳峰等于2011 年对我国13 省区（市）采集的122 份临床诊断为山羊传染性胸膜肺炎（Contagious caprine pleuropneumonia，CCPP）或疑似羊支原体性肺炎（Mycoplasma pneumonia of sheep and goats，MPGS）的病料进行病原分离和PCR 检测，首次检测和分离到1 株Mcc[7]，表明我国羊群中存在Mcc 感染，山羊支原体疾病的病原日趋复杂，给有效防治CCPP 和MP⁃GS 带来了新的挑战。目前，羊呼吸道疾病和乳腺炎是临床上影响福建省养羊业发展的主要疾病，这些疾病的频繁发生是否与Mcc 有关？由于未对Mcc 在福建省的感染状况进行调查，情况不明，因此很有必要开展Mcc 感染的分子流行病学调查。此外，由于丝状支原体山羊亚种（Mycoplasma mycoides subsp.capri，Mmc）、无乳支原体（Mycoplasma agalactiae，M. agalactiae）、腐败支原体（Mycoplasma putrefaciens，M. putrefaciens）和Mcc 均可引起CA，且临床症状极为相似，因此Mcc 的感染只能通过实验室检测后确诊[8]。目前国外关于Mcc 的检测方法主要有病原的分离鉴定、血清学方法[9]、PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）[5]、PCR-限制性酶切分析（PCRREA）[10]，但Mcc 对培养基营养要求高，培养非常困难，培养周期长，且其生长容易被其他支原体所抑制；与同属支原体在血清学上的交叉反应使血清学方法不适用于该病的诊断。因此，诊断该病的首选方法是分子生物学方法。然而常规PCR 方法存在灵敏度低、假阳性结果、不能定量等缺点，这些方法均不适用于Mcc 的快速、准确检测。因此，建立一种准确、快速、高通量的Mcc 检测方法对Mcc 感染的流行病学调查、快速诊断和有效防控尤为重要。荧光定量PCR（qPCR）方法具有操作简便、特异性强、敏感性高且结果全程可监控等优点。目前尚无关于Mcc 荧光定量PCR 检测方法的报道，因此本研究根据MCAP_0033 基因利用软件设计特异性引物和探针，建立Mcc TaqMan 荧光定量PCR（qPCR）方法，以期为Mcc感染的早期快速检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料Mcc California Kid 株和山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp. cap⁃ripneumoniae，Mccp）F38 株由中国农业科学院兰州兽医研究所提供；精氨酸支原体（Mycoplasma argi⁃nine，M. arginini）PG2 株由西南民族大学提供；大肠杆菌（Escherichia coli，Ec）、巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus au⁃reus，SA）等由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室提供；绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovi⁃penunimoae，Mo）、伪结核棒状杆菌（Corynebacterium psedotuberculosis，CP）、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica，Mh）、莱氏无胆甾原体（Acholeplas⁃ma laidlawii，AL）、牛支原体（Mycoplasma bovis，Mb）及Mmc 均为本研究室分离、鉴定和保存。47 份肺脏组织样品来自2017 年～2019 年福建省福州市、三明市、南平市和莆田市临床上疑似羊支原体性肺炎的患羊。组织/细菌DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程股份有限公司；Premix Ex TaqTM（Probe PCR）、pMD19-T载体均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 引物的设计合成根据GenBank 登录的Mcc ATCC27343 株的MCAP_0033 基因序列（CP000123.1），利用Beacon Design 7.9 软件设计1 对特异性引物和探针：MccF：5'-GCTAGTTGGAATATATGATAATG-3'/MccR：5'-CCACCTGCTAATCCTAAA-3'。Mcc probe：5'-AATCAACTTCAACATTAGGTCTGCAA-3'。目的片段为101 bp。引物和探针均由福州白鲸生物技术有限公司合成。

1.3 参考株和临床样品核酸的提取及标准品的制备将约1 g临床肺脏样品剪碎后与PBS按照1∶9的比例研磨成组织匀浆液后，反复冻融3 次，5 000 r/min 离心15 min，取上清用于提取组织DNA。利用试剂盒提取1.1 各菌株和47 份临床肺脏样品DNA。本研究是基于Mcc California Kid 模式株建立的Mcc TaqMan qP⁃CR 方法，因此在提取California Kid 菌株DNA 后，利用NanoDrop 2000 超微量分光光度计测定该DNA 浓度，参照文献[11-12]换算成拷贝数，作为阳性标准品备用。

1.4 MccTaqMan qPCR 反应条件的优化和标准曲线的建立按照Premix Ex TaqTM（Probe PCR）试剂盒说明书建立25 μL 反应体系：MccF、MccR 引物（10 μmol/L）各0.5 μL，Mcc probe（5 μmol/L）1 μL，模板2 μL，Premix Ex TaqTM（Probe PCR）12.5 μL，去离子水补足至25 μL。以出现最高荧光值及最小的Ct 值作为判断依据，分别对退火温度（50 ℃～65 ℃）、引物浓度（5 μmol/L～10 μmol/L）和探针浓度（5 μmol/L～10 μmol/L）进行优化。将提取的标准品10 倍倍比稀释（108拷贝/μL～101拷贝/μL）后作为模板，按照优化好的反应体系和反应条件进行qPCR扩增，试验重复4 次。反应结束后利用电脑软件绘制标准曲线。

1.5 MccTaqMan qPCR 的特异性试验利用1.4 优化的反应体系和条件分别对Mcc、CP、Mmc、Mo、Ec、Pm、SA、Mccp、M. arginini、Mb、AL、Mh 的核酸进行qPCR 扩增，以去离子水作空白对照，评估该方法的特异性。

1.6 MccTaqMan qPCR的敏感性试验利用建立的TaqMan qPCR和Cillara等[5]建立的常规PCR方法分别对10倍倍比稀释的Mcc DNA（108拷贝/μL～100拷贝/μL）进行扩增，比较两种方法的敏感性。

1.7 MccTaqMan qPCR 的重复性试验将1×108拷贝/μL、1×107拷贝/μL、1×106拷贝/μL和1×105拷贝/μL 4 个浓度的Mcc DNA 按照1.4 优化的反应体系和反应条件进行3 次qPCR 检测，每次设3 个重复，根据Ct值计算组内变异系数；将上述4 个浓度的Mcc DNA每间隔3 d 进行1 次qPCR 检测，重复3 次，每次设3个重复，根据Ct 值计算出组间变异系数，对该方法的重复性进行评估。

1.8 临床样品检测以47 份临床肺脏样品的DNA为模板，利用建立的TaqMan qPCR 方法扩增，设California Kid 株作为阳性对照。并与Cillara 等[5]建立的常规PCR 及储岳峰等[7]建立的支原体分离鉴定方法进行比较，并分别计算本研究建立的方法与这两种方法的符合率。

2 结 果

2.1 MccTaqMan qPCR反应条件的优化结果通过对引物和探针浓度以及退火温度等条件的优化，最终确定25 μL 反应体系：MccF/MccR 引物（10 μmol/L）各0.5 μL，Mcc probe（5 μmol/L）1 μL，模板2 μL，Pre⁃mix Ex TaqTM（Probe PCR）12.5 μL，去离子水补足至25 μL。优化的反应程序为95 ℃10 s；95 ℃5 s，54 ℃10 s，72 ℃20 s，共40 个循环。

2.2 标准曲线的建立经NanoDrop 2000 超微量分光光度计测定，Mcc DNA 浓度为55.6 ng/μL，换算成拷贝数为3×1010拷贝/μL。利用优化后的反应条件对浓度为108拷贝/μL～103拷贝/μL 的标准品进行扩增，并绘制标准曲线。结果显示，Mcc TaqMan qPCR 方法对California Kid 菌株DNA 阳性标准品在1×108拷贝/μL～1×103拷贝/μL 与Ct 值有很好的线性关系，相关系数为0.988，扩增效率为101%（图1）。

2.3 MccTaqMan qPCR 特异性试验结果利用建立 的TaqMan qPCR 方 法 对Mcc、CP、Mmc、Mo、Ec、Pm、SA、Mccp、M. arginini、Mb、AL、Mh 和ddH2O 进行检测，结果显示，除Mcc 能扩增出S 型曲线外，其他样品均未见扩增（图2），表明本研究建立的TaqMan qPCR 方法特异性较强。

图2 TaqMan qPCR 特异性试验结果Fig. 2 Specificity analyses using TaqMan qPCR

2.4 MccTaqMan qPCR的敏感性试验结果将提取的Mcc California Kid 株DNA 10 倍倍比稀释成1×108拷贝/μL～1×100拷贝/μL，利用建立的TaqMan qPCR方法检测，同时利用常规PCR 方法进行检测，以比较二者的敏感性。结果显示TaqMan qPCR 对Mcc 的检测限为10 拷贝/μL（图3），常规PCR 的检测限为104拷贝/μL（图略），TaqMan qPCR 敏感性为常规PCR 的10 00 倍。表明TaqMan qPCR 敏感性较高。

图3 TaqMan qPCR 的敏感性试验结果Fig. 3 Sensitivity analyses using TaqMan qPCR

2.5 MccTaqMan qPCR 的重复性试验结果选取1×108拷贝/μL、1×107拷贝/μL、1×106拷贝/μL 和1×105拷贝/μL 的Mcc DNA 分别进行组内和组间重复性试验。经计算结果显示，组内和组间变异系数均小于2%（表1），表明建立的Mcc TaqMan qPCR 方法具有较好的重复性及稳定性。

2.6 临床样品检测将建立的TaqMan qPCR 方法、常规PCR 和支原体分离鉴定方法同时对47 份临床肺脏样品进行检测， TaqMan qPCR 方法和常规PCR 结果显示，除Mcc DNA 检测结果呈阳性外，临床样品均未检测到Mcc，47 份临床样品也均未分离到Mcc。表明福建省尚无Mcc 的流行，但可能也与检测样品仅为肺脏组织有一定关系。

表1 Mcc TaqMan qPCR 的重复性试验结果Table 1 Reproducibility assay of the TaqMan qPCR assay for detecting Mcc

3 讨 论

Mcc 属于丝状支原体簇成员之一，丝状支原体簇是柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属下一群遗传上和血清学关系相近的支原体，同属成员还有Mmc、Mccp、丝状支原体丝状亚种小菌落型（Mycoplasma mycoides subsp. mycoides Small Colony，MmmSC）和李奇氏支原体（Mycoplasma leachii，Ml）[13]，由于丝状支原体簇成员之间同源性较高，Mcc 在血清学上与同属其它成员之间存在交叉反应，导致Mcc 检测方法的研究进展缓慢。目前国外实验室常以支原体的分离培养鉴定和PCR 方法为主，但支原体分离鉴定法存在分离率低，培养时间长等不足，而常规PCR 方法存在不能定量且假阳性率高等缺点。因此，亟需建立Mcc 快速准确的检测方法，为该病的早期诊断供技术支持。

TaqMan 探 针 法qPCR 是 利 用Taq 酶 的3'～5'外 切核酸酶活性，切断探针，从而产生荧光信号。在反应过程中由于探针与模板的特异性结合，因此荧光信号的强弱能够反映模板的数量。具有操作简便、特异性强、敏感性高、反应过程可视化等优点[12]，已被广泛应用于兽医领域研究中。

由于丝状支原体GC 含量较低且其使用UGA 密码子编码色氨酸，很少使用UGG，这就使得支原体的引物设计更加困难[14]。本研究通过下载GenBank登录的Mcc 全基因组序列，利用BLAST 在线软件比对分析后发现MCAP_0033 基因仅存在于Mcc 和Mccp基因组中，利用MegAlign 软件对Mcc 和Mccp 的MCAP_0033 基因进行比对分析，结果显示两者核苷酸相似性仅为40.6%，因此本研究最终选择MCAP_0033 基因作为靶基因设计引物。通过一系列条件优化，建立了Mcc TaqMan qPCR 方法。构建的标准曲线显示，相关系数为0.988，扩增效率为101%，表明该方法准确性好；该方法仅能扩增Mcc，而其他羊常见病原均不能扩增，表明本研究建立的该方法特异性强；重复性试验结果显示，组内和组间变异系数均小于2%，表明该方法稳定性好。武昱孜等建立了猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重qPCR 检测方法，对这两种病原的最低检测限均为10 拷贝/μL[15]；李建等建立了牛支原体qPCR 检测方法，对牛支原体的最低检测限为10 拷贝/μL，比常规PCR 敏感性高10倍[16]；Lin 等建立了Mmc qPCR 检测方法，对Mmc 的最低检测限为11 拷贝/μL，比常规PCR 灵敏度高1 000倍[17]。本研究建立的Mcc检测方法同样具有较高的敏感性，对Mcc DNA 的最低检测限为10 拷贝/μL，比常规PCR 方法敏感性高1 000 倍。

利用本研究建立的Mcc TaqMan qPCR 方法对福建省采集的47 份病羊肺组织样品进行了检测，并与支原体分离鉴定法和常规PCR 方法进行了比较，结果表明该方法与支原体分离鉴定法结果一致，进一步证明了该方法的准确性。本研究临床样品中未检测到Mcc 的原因可能与样品采集有一定关系，本研究采集的均为肺脏样品，而国外研究报道该病在肺脏中的检出率和分离率较低，在乳汁和耳道中检出率高[4,8]，在今后样品采集过程中应当注意采样部位，以提高检出率。此外，本研究仅利用了1 株国际标准株California Kid 检测所建TaqMan qPCR 方法的特异性，缺少丝状支原体簇成员中的MmmSC 和Ml菌株，使得特异性试验不够完善，但是，本研究在设计引物和探针时，选定的引物和探针序列经BLAST在线软件比对分析后，与Mcc 菌株MCAP_0033 基因序列同源性为100%，与其他羊相关病原相应基因的同源性均低于57.7%，说明本研究设计的引物和探针是特异的。今后还要用更多的Mcc、MmmSC 和Ml 菌株来验证该方法的特异性。

本研究首次建立了Mcc TaqMan qPCR 方法，可用于Mcc 的早期检测，为该病的防控提供技术支撑，也为今后该病商品化诊断试剂盒的研制奠定了基础。