猪德尔塔冠状病毒BJ 株的分离鉴定与致病性分析

刘秋歌，王洪峰，范前进，冯 力*，陈建飞*

（(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪消化道传染病创新团队，黑龙江 哈尔滨 150069；2.哈尔滨维科生物技术有限公司，黑龙江 哈尔滨 150069）

猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）是一种新发的猪冠状病毒，能够引起猪肠道疾病。该病主要以呕吐、腹泻、脱水和仔猪死亡为特征，给养猪业造成了严重的经济损失。PDCoV是有囊膜的、单股正链RNA 病毒，是尼多目（Nido⁃virales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒亚科（Coronavirinae）德尔塔冠状病毒属（Deltacoronavirus genus）成员。其基因组长约25.4 kb，基因组结构为：5'UTR-开放阅读框（Open reading frame，ORF）1-S-E-M-ORF5-N-ORF7-3'UTR[1]。PDCoV 于2012 年在中国香港首次报道[2]，但PDCoV 是否具有临床致病性在该研究中尚未报道。2014 年2 月PDCoV 在美国腹泻猪群中首次出现，并蔓延至美国20 多个州以及加拿大的部分地区[3]。随后，在韩国、中国大陆、泰国和越南等亚洲国家也发现了PDCoV[4]。

目前，对PDCoV 的分离培养主要采用猪肾细胞（LLC-porcine kidney，LLC-PK）和猪睾丸（Swine tes⁃tis，ST）细胞[5]。Hu 等利用LLC-PK 和ST 细胞成功从腹泻仔猪的病料样品中分离到PDCoV OH-FD22株，并对其致病性进行了研究[6]。陈建飞等利用LLC-PK 细胞从黑龙江省某猪场腹泻仔猪的病料样品中成功分离得到国内首株PDCoV NH 株[7]。本研究将经RT-PCR 检测为PDCoV 阳性的仔猪腹泻样品无菌处理后接种ST 细胞并进行体外传代培养，利用RT-PCR、间接免疫荧光法（IFA）、电镜观察、全基因组序列分析和致病性试验对分离的病毒株进行鉴定，为进一步开展PDCoV 致病机制、诊断制剂和疫苗研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料15 日龄～20 日龄仔猪小肠及内容物采集自北京地区某猪场；胎牛血清购自金源康公司；DMEM 培养基、青链霉素、2.5%胰酶均购自Gibco 公 司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 购 自QIAGEN公司；PrimeScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit、Em⁃eraldAmp PCR Master Mix、pMD18-T 载 体 均 购 自TaKaRa 公司；鼠抗PDCoV N 蛋白单克隆抗体（MAb）由本实验制备和保存；兔抗鼠FITC-IgG、过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG（全分子）购自Sigma 公司；山羊抗小鼠IgG/Alexa Fluro 488 购自北京中杉金桥生物技术有限公司；胶回收试剂盒购自OMEGA 公司；质粒提取试剂盒购自Axygen 公司。

1.2 病毒的分离及鉴定

1.2.1 病毒的分离 采用RT-PCR 方法对收集的病料样品进行检测，将PDCoV阳性小肠内容物样品和灭菌PBS 按1∶5 的质量体积比制成悬液，5 000 r/min，4 ℃离心10 min，吸取上清，0.45 μm 滤器过滤，接种ST 单层细胞，37 ℃吸附1 h 后用灭菌PBS 洗3 遍，添加维持液后继续培养。每天观察细胞生长情况和细胞病变（CPE）。经盲传将出现CPE 的细胞及其上清液反复冻融3 遍后继续传代培养，当出现90%以上的CPE 时，收获病毒，噬斑纯化后在ST 细胞上连续传代至第13 代（P13）。

1.2.2 分离病毒的电镜观察 将第13 代细胞培养液反复冻融3遍后，取1 000 μL 4 ℃，5 000 r/min离心10 min，去除细胞碎片，将上清于4 ℃，12 000 r/min离心30 min，弃掉大部分上清，利用剩余液体重悬沉淀，用2%磷钨酸负染后经透射电镜观察。

1.2.3 分离病毒的IFA 鉴定 同时，6 孔板中的ST 细胞感染病毒18 h后弃掉上清液，以4%多聚甲醛在4 ℃固定30 min，经0.1%Triton-X100 在室温作用20 min，5%脱脂乳封闭1 h；以鼠抗PDCoV N 蛋白MAb 为一抗（1∶1 000 稀释），以山羊抗小鼠IgG/Alexa Fluro 488 为二抗（1∶500稀释）对分离的病毒进行IFA鉴定。

1.2.4 分离病毒的PCR 鉴定 参照GenBank 中登录的PDCoV HKU15-44 株全基因组序列（JQ065042），利用Oligo 6.0 设计1 对扩增N 基因的特异性引物，引物序列为F：5'-TCAATGGTGAGCCTTTACTGCTT-3'/R：5'-ATCGGGATGTGATTCTGTGCTAG-3'。片段大小为1 209 bp，引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。取第13 代（P13）细胞培养液140 μL，参照QIAamp Viral RNA Mini Kit 说明书提取病毒RNA，反转录合成cDNA。PCR 反应条件为：95 ℃5 min；98 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃90 s，30 个循环；72 ℃10 min；同时设病毒RNA 对照。PCR 产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 病毒全基因组测序参照GenBank 中登录的PDCoV HKU15-44 株全基因组序列（JQ065042），利用Oligo 6.0 设计19 对扩增全基因组序列的特异性引物（如读者需要，作者可以提供相关引物序列）。以P13 代病毒的cDNA 为模板，分别用19 对引物PCR扩增目的片段。PCR 反应条件同上，PCR 产物回收纯化后克隆至pMD18-T 中，重组质粒由吉林省库美生物科技有限公司测序，每个片段至少送3 个阳性克隆进行测序分析。利用生物信息学软件对分离株的基因组序列进行比对、拼接。利用MEGA 7.0.26软件中的NJ法构建全基因组序列的系统发育树，分析分离株和参考株之间的亲缘关系。

1.4 动物回归实验将4 头3 日龄的猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PoRV）、PDCoV 抗原阴性的哺乳仔猪随机分为感染组（n=2）和对照组（n=2）。感染组每头猪口服105TCID50/mL 的BJ 株（P13）2 mL；对照组口服2 mL细胞维持液，接种后定时观察仔猪的临床表现。待出现临床症状后迫杀全部仔猪，采集其肠组织于10%中性甲醛中固定，利用HE 染色观察组织病变；同时，以PDCoV N 蛋白MAb（1∶25 稀释）为一抗，以过氧化物酶标记的兔抗鼠HRP-IgG（全分子）（1∶400 稀释）为二抗，进行免疫组织化学试验，检测各组猪肠组织中的病毒抗原。

2 结果与讨论

2.1 病毒的分离及鉴定结果将无菌处理的PDCoV阳性样品接种到ST 细胞培养，盲传至第3 代后出现典型的CPE；而对照组无明显变化（图1A）。经噬斑纯化后继续传代（图1B）。取P13 代的病毒细胞培养液经电镜观察可见，在细胞培养上清中存在典型的冠状病毒粒子（图1C）。以特异性的鼠抗PDCoV N 蛋白MAb 对病毒感染的ST 细胞进行IFA 检测，结果显示病毒感染的ST 细胞中有特异性的荧光，而正常对照细胞未出现荧光（图1D）。利用针对N 基因的特异性PCR 能够检测到目的条带（图1E）。综上结果表明分离到一株PDCoV，并将其命名为BJ 株。研究表明在相同的条件下PDCoV 对LLC-PK 细胞中比对ST 细胞更易感，说明LLC-PK 细胞更有利于PDCoV 的分离[8]。本研究在ST 细胞中分离传代的BJ 株，P13 代的病毒滴度为105.75TCID50/mL；而Zhao 等在LLC-PK细胞分离的CHN-SC2015 在P10 代的病毒滴度为107TCID50/mL[9]；可能是因为PDCoV 对ST 细胞的敏感性低于LLC-PK 细胞造成病毒在ST 细胞中增殖较慢。

2.2 全基因组序列同源性分析结果从BJ P13 代的细胞培养液中提取RNA 并反转录成cDNA，利用设计的19 对引物进行全基因组扩增（图2A）。经测序，序列拼接及比对后结果显示，与参考株序列相比，PDCoV BJ 株的S 基因中缺失3 个碱基，这一点是除了CHN-AH-2004 外，其他中国病毒株所共有的独特结构。纤突（Spike，S）基因编码的S 蛋白在病毒表面形成三聚体，具有结合宿主受体、促进膜融合和诱导产生中和抗体等作用[10]。将PDCoV BJ 株的S 基因核苷酸序列以及对应的氨基酸序列与本实验室分离的黑龙江地区NH 株进行比对分析显示，BJ 株与NH 株在S 基因上无核苷酸插入或缺失，但存在45 个核苷酸点突变，并导致其编码的6 个氨基酸位点突变，分别为H21D、L45H、Y122H、V136A、T644A、I1015V。有研究将S 蛋白截成3 段并利用大肠杆菌表达系统表达了重组蛋白，对重组蛋白的免疫原性评价结果表明3 段重组蛋白产生的抗血清均具有中和病毒的能力，其中以S1 的CTD（aa278～aa616）表达的重组蛋白产生的抗血清具有最强的中和效果[11]。BJ 株与NH 株S 基因核苷酸序列存在较多的突变，这些突变导致了S 蛋白6 个氨基酸位点突变。这些突变对病毒的抗原性、病毒增殖能力和致病性影响有待后续研究。基于BJ 株（P13 代）和PDCoV 国内外参考株的全基因组序列的系统发育分析结果表明，来自美国和韩国的PDCoV 聚集在一个大的分支中，而BJ 株（红色圆圈标注）与中国检测到的PDCoV聚集在一起，泰国、越南和老挝的PDCoV 聚集在一个明显的分支中（图2B）。因此，这些数据表明BJ株与中国大陆的PDCoV 株亲缘关系较近，提示我国的PDCoV 可能来自一个共同的祖先。同时利用RDP4 软件进行了重组分析，结果未发现BJ 株存在重组现象。

图1 PDCoV BJ 株的分离鉴定结果Fig. 1 The isolation and identification of PDCoV BJ strain

图2 PDCoV BJ 株全基因扩增（A）和系统发育分析（B）Fig. 2 The complete genome amplification (A) and phylogenetic analysis (B) of PDCoV BJ strain

2.3 BJ株动物回归实验结果口服接种BJ株后24 h，感染组2 头仔猪表现为精神沉郁、厌食，无腹泻。口服接种后27 h，感染组2 头仔猪开始出现腹泻症状，排出黄色水样粪便；而对照组无异常表现。出现腹泻后12 h 将仔猪全部迫杀，剖检可见十二指肠、空肠、回肠肠壁变薄，其内充满气体和黄色水样稀便。组织病理学结果显示，感染猪回肠和空肠的小肠绒毛长度显著变短，而十二指肠、盲肠、结肠和直肠的绒毛与对照猪相比无显著变化（图3A）。免疫组化结果显示，在感染猪的空肠和回肠检测到大量PDCoV抗原，而在十二指肠、盲肠、结肠和直肠与对照组猪的相应肠组织中未检测到病毒抗原（图3B），表明空肠和回肠是PDCoV BJ 株体内感染和复制的主要部位。Zhang 等人对PDCoV NH 株在细胞中传代10 次的病毒株进行了致病性试验，结果表明NH P10 对5日龄仔猪具有强致病性[12]。本研究用于感染试验的BJ P13 株对3 日龄仔猪具有高致病性，其产生的组织病变与Zhang 等人的结果一致。Madson 等人的研究表明在PEDV 感染的小肠组织切片中均观察到了病变[13]，而本研究中只在PDCoV BJ 株感染仔猪的空肠和回肠观察到病变，表明PDCoV 引起的组织损伤比PEDV 引起的组织损伤轻。

图3 PDCoV BJ 株感染猪和对照猪肠组织的病理变化（A）和抗原分布（B）Fig. 3 Histopathology (A) and antigen distribution (B) of PDCoV BJ strain in infected piglets and control piglets

由于目前无针对PDCoV 的特效治疗药和商品化疫苗，PDCoV 感染日趋普遍，为我国养猪业造成了潜在威胁。此外，Jung 在研究中发现PDCoV 可以感染3 日龄～7 日龄犊牛并在粪便中检测到病毒核酸，在血清中检测到针对PDCoV 的特异性抗体[14]。PD⁃CoV 可以感染鸡胚，能够在鸡胚上连续传代但并不引起鸡胚的死亡，接种SPF 鸡可以引起轻度感染[15]。这些研究结果表明PDCoV 存在跨种间传播的风险，因此加强PDCoV 的临床检测和病毒分离、鉴定是非常必要的。本研究分离到PDCoV BJ 株并对其致病性进行了评估，获得了分离株全基因组序列，对了解我国PDCoV 的遗传演化具有重要意义，丰富了病毒资源库，为进一步研究该病毒的致病机制、诊断试剂研制和疫苗开发奠定了实验基础。