用于CRISPR 文库筛选的N2a-Cas9 细胞系的构建

2021-01-22 02:56张纪文王露露赵东明步志高
中国预防兽医学报 2020年12期
关键词:细胞系病毒感染宿主

张纪文,王露露,李 芳,刘 杏,赵东明,步志高

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150069)

CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9)是存在于细菌或古生细菌中的一种抵御外源DNA侵入的适应性免疫反应系统[1]。目前,CRISPR/Cas9作为一种能够对哺乳动物细胞基因组进行精准修饰的技术,被广泛应用在功能性基因的筛选[2]。最近,利用CRISPR/Cas9 高通量筛选技术研究基因功能、基因治疗、药物研发、疾病作用机理和病毒宿主相互作用的关键分子筛选等方面取得了重大进展[3-6]。狂犬病是一种急性致死性的人兽共患传染病;病毒在细胞内寄生,具有严格的嗜神经性[7]。当前尚未见基于CRISPR/Cas9 高通量筛选研究狂犬病病毒(RV)感染神经细胞的报道,因此本研究构建稳定表达Cas9蛋白的N2a-Cas9 单克隆细胞系,为基于CRISPR/Cas9全基因组高通量筛选技术探究神经细胞内关键宿主基因调控RV 嗜神经性提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 质粒与细胞株人胚胎肾细胞(Human embo⁃rynic kidney cell,HEK293T)、鼠神经瘤母细胞(N2a)细胞株由本实验室保存。LentiCas9-Blast 质粒、pXPR-011 质粒、慢病毒pMD2.G、pSPA X2 骨架质粒购自Addgene 公司。

1.2 主要试剂大肠杆菌DH5α 感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;兔源Cas9 单克隆抗体(MAb)和HRP 标记山羊抗兔IgG 抗体(IgG-HRP)购自Abcam 公司;Polybrene、杀稻瘟菌素(Blasticidin)、Puromycin 购自Sigma 公司;CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay 购自Promega 公司;TransIT®-Len⁃ti Transfection Reagent 购自Mirus 公司。

1.3 慢病毒的包装和感染剂量的确定按照TransIT®-Lenti Transfection Reagent 说明书方法,将LentiCas9-Blast、pMD2.G 和pSPA X2 共 转 染 至HEK-293T,包装慢病毒。72 h 后收集慢病毒上清液并离心,再用0.45 μm 滤器过滤。将慢病毒按照不同剂量(320 μL、160 μL、80 μL、40 μL、20 μL、10 μL、5 μL)感染N2a 细胞,设不加慢病毒及无杀稻瘟菌素的细胞对照组。慢病毒感染24 h 后,换为含有20 μg/mL 杀稻瘟菌素的完全培养基。对于无抗生素选择的对照孔,换为完全培养基。在不同的感染剂量下分析存活细胞数的差异来确定最佳慢病毒感染剂量。

1.4 慢病毒转染和N2a 表达Cas9 蛋白细胞系的获得将含LentiCas9-Blast 慢病毒的上清液以MOI 0.3感染N2a 细胞,加入含10 μg/mL Polybrene DMEM 培养基,于37 ℃、5% CO2培养箱培养72 h,更换为新鲜的选择培养基。阴性对照组细胞全部死亡时,初步筛选出阳性细胞。采用终点稀释法对阳性细胞株亚克隆并扩大培养,扩大培养后取细胞,用RIPA 裂解液裂解细胞,取细胞裂解液进行SDS-PAGE(7.5%),之后将蛋白质转印至0.2 μm PVDF 膜上,用5%脱脂牛奶封闭,以兔源Cas9 MAb(1∶1 000)为一抗,以羊抗兔IgG-HRP(1∶10 000)为二抗孵育。采用化学发光系统检测N2a 细胞系表达的Cas9 蛋白,最终获得N2a-Cas9 细胞系。

1.5 表达Cas9 蛋白的N2a 细胞切割活力检测按照1.3 的步骤将质粒pXPR-011 包装成慢病毒。用pXPR-011 包装的慢病毒感染N2a 和N2a-Cas9 细胞系(MOI 1)。48 h 后,更换含有2 μg/mL 嘌呤霉素完全培养基,继续培养。14 d 后,将N2a 细胞系和转导pXPR-011 的N2a 细胞系分别作为阴性和阳性对照,用流式细胞仪CytomicsTMFC 500对样本进行分析。

1.6 N2a-Cas9 细胞活力检测将处于对数生长期的N2a 和N2a-Cas9 细胞计数,使细胞数约为5×104个/100 μL,每种细胞设4 个复孔,接种到96 孔不透明细胞培养板中培养24 h。按照CellTiter-Glo 试剂盒操作步骤检测细胞的增殖活力,最后用Glomax96 microplate luminometer 检测发光信号值,比较分析两种细胞系的活力差异。

2 结果与讨论

2.1 慢病毒感染剂量的确定将含慢病毒上清液进行倍比稀释,使病毒以不同剂量感染N2a 细胞系。在抗生素加压筛选72 h后,当不加病毒对照组的细胞全部死亡,且无抗生素对照组细胞密度为80%~90%。使用Logos Luna Ⅱ自动细胞仪计数细胞数量。结果显示慢病毒感染剂量与细胞存活率存在剂量依赖关系(图1)。为了保证每个细胞仅感染一个慢病毒,本实验选取感染率为30%作为最佳慢病毒感染剂量。结果表明,40 μL 慢病毒为理想的病毒感染剂量,经计算病毒滴度为1.8×106TU/mL。感染率=抗生素选择条件下的细胞数量/无抗生素选择下的细胞数量,病毒滴度(TU/mL)=(初使感染细胞数×感染率)/(每孔感染病毒体积)×1 000。

2.2 表达Cas9 蛋白N2a 细胞系的获得用RIPA 裂解缓冲液提取总蛋白,以N2a 细胞裂解液为阴性对照。Western blot 结果显示,2 号和9 号细胞系的Cas9 蛋白表达水平较高(图2)。表明2 号和9 号比较适合后续N2a 细胞系Cas9 蛋白切割活力的检测。

图2 Western blot 分析N2a 细胞表 达的Cas9 蛋白Fig. 2 Western blot analysis for the expression of Cas9 protein in N2a cells

2.3 表达Cas9 蛋白的N2a 细胞切割活力检测结果质粒pXPR-011 同时含有GFP 和针对GFP 的gRNA 序列,细胞内Cas9 蛋白会在gRNA 的引导下对GFP 基因进行切割,因此细胞表达的GFP 越少,说明Cas9 蛋白的切割活力越高。采用质粒pXPR-011包装成的慢病毒分别感染N2a 和N2a-Cas9 细胞系14 d 后,利用流式细胞仪CytomicsTMFC 500 对样本进行分析。结果显示,2 号单克隆细胞系表达的GFP较少,Cas9 切割活力较好,且Cas9 蛋白能在N2a 细胞中稳定表达(图3)。表明2 号N2a-Cas9 细胞系可以用于CRISPR 文库筛选。

2.4 N2a-Cas9 细胞系活性的测定结果采用CellTiter-Glo 试剂盒检测N2a 和2 号N2a-Cas9 细胞系的增殖活力。结果显示,在相同的条件下,与对照细胞相比两者无差异(图4)。结果表明,Cas9 蛋白不影响细胞的增殖活性。

RV 侵入宿主细胞是由细胞受体介导的膜吸附启动的感染过程[8]。目前,一些研究人员已经发现了多种受体在病毒吸附阶段发挥了重要作用,但这些均不是严格意义上的特异性受体[9]。有学者以小鼠N2a 细胞为模型研究RV 感染过程中的嗜神经性,发现在感染过程中细胞伴侣蛋白CCTγ 能够促进RV 复制[10]。基于能够进行多重测序的二代测序技术,可以利用构建的N2a-Cas9细胞,结合Addgene上的鼠全基因组sgRNA 文库以及本实验室构建的ERA-GFP 报告病毒,在单细胞水平上进行大规模干扰表型实验,筛选能调控RV 侵染宿主细胞的关键宿主因子[11]。因此,本研究利用慢病毒转导系统构建了稳定表达Cas9 蛋白的N2a-Cas9 单克隆细胞系,为基于CRISPR/Cas9 全基因组高通量筛选技术鉴定RV 嗜神经性相关特异性受体及探究病毒与宿主蛋白相互作用机制提供研究基础。

图3 检测N2a 细胞Cas9 蛋白的切割活力Fig. 3 Detection of Cas9 protein cleavage activity in N2a cells

图4 N2a-Cas9 细胞系中Cas 基因的表达对细胞增殖活性的影响Fig. 4 The analysis of cell proliferation activity on N2a-Cas9 cell line with the expression of Cas

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