目舒丸对兔眼睫状体平滑肌细胞内舒缩传导信号的影响

宿蕾艳，张莎莎，张明明，魏春秀，方素萍，王颖，胡瑛，庄曾渊

眼部调节和集合功能异常，睫状肌和内直肌功能紊乱，可导致神经支配的异常或肌肉的过度紧张，引起视疲劳。眼的调节功能是依赖睫状体平滑肌的收缩和舒张来实现的，与细胞内游离钙水平关系密切。大鼠肉瘤（rat sarcoma，RAS）同源基因家族成员A（ras homolog gene family member A，RhoA）及蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是平滑肌收缩的关键信号蛋白[1-3]。中医认为视疲劳属于“肝劳”，其核心病机是阴血不足、筋膜挛急。目舒丸为中国中医科学院眼科医院的院内制剂，具有活血养血，解痉止痛的功效，临床上用于治疗视疲劳，疗效确切[4-5]。本实验拟在细胞水平观察目舒丸对兔眼睫状体平滑肌细胞舒缩的影响，研究目舒丸治疗视疲劳的机制，为其临床合理应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验用3 月龄新西兰大白兔，10 只，体重2.5～3.0 kg，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养条件：12 h/12 h 交替光暗，温度25℃，湿度55%左右，自由饮食、饮水，动物房环境保持安静、通风良好。

1.2 主要试剂与仪器

氯化乙酰胆碱（上海梯希爱化成工业发展有限公司，批号：A0084）；二氧化碳培养箱（美国Thermo公司，型号：HERA CELL 150）；超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司，型号：SCB-1360）；倒置显微镜（美国，型号：OLYMPUS B071）；冷冻离心机（美国Sigma 公司，型号：1-14PK），酶标仪（美国BioRad 公司，型号：1450）；实时荧光定量聚合酶链式反应仪（美国BIO-RAD，型号：CFX96），基因扩增仪（美国BIO-RAD，型号：C1000）。

1.3 取材

取上述新西兰大白兔，无菌条件下摘取兔眼球，用含双抗的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗，沿角膜缘后3 mm 处切开眼球，去除晶体，剪除虹膜，取下完整睫状肌带，冲洗后剪碎，加入3 mL V 型胶原酶消化2 h，终止消化，1500 r/min离心5 min，于沉淀中加入平滑肌细胞培养液，吹打均匀，得到原代兔眼睫状体平滑肌细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。2～3 d 后细胞传代培养，传代得到第3 代睫状体平滑肌细胞可用于后续相关实验。

目舒丸溶液配置：称取160 mg 目舒丸颗粒加入10 mL 细胞培养液充分溶解，之后使用0.45 μm 微孔滤膜进行过滤，得到浓度为16 mg/mL 的目舒丸浓溶液，浓溶液用于稀释不同终浓度目舒丸溶液。

1.4 分组与给药

将1.3 得到的第3 代睫状体平滑肌细胞以1×106个/mL 均匀接种于5 个6 孔板中，铺板24 h 后，随机选出27 个接种孔，并随机分为9组，每组3 个孔，分别命名为A组～I组。将1.3 得到的目舒丸溶液稀释成7 个浓度，依次为8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL 并分别加入到A～G组中，继续培养细胞10 min。H组予氯化乙酰胆碱（0.5 mmol/L）继续培养2 h，I组予目舒丸溶液（1.0 mg/mL）继续培养24 h，之后予氯化乙酰胆碱（0.5 mmol/L）培养2 h。

1.5 兔眼睫状体平滑肌细胞长度测定

A组～G组在给药前及给药后的0.5、1、2、4 和10 min 这6 个时间点，分别在相差显微镜下用测微器测定细胞直径，每个接种孔观察6 个视野，每个视野测10 个细胞，取其平均值进行统计分析。

1.6 兔眼睫状体平滑肌细胞内PKC、RhoA 基因表达

将H组和I组细胞离心，收集各组细胞，进行实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）。按照总核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）抽提试剂说明书提取总RNA（表1）。反转录：各组样品取1 μg总RNA，按M-MLV First Strand RT Kit 试剂盒说明书进行cDNA 反转录合成。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测：以上述反转录cDNA 为模板，应用荧光定量PCR 检测细胞中PKC、RhoA 的基因表达。25 μL 反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，灭菌双蒸水补足至25 μL。扩增条件为预变性95℃3 min，变性94℃30 s，退火72℃3 min，以上2 步扩增循环。每个循环结束后收集荧光信号，反应结束后确认扩增曲线和融解曲线。再根据2-ΔΔCt公示计算目的基因的表达量。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.7 统计学方法

采用SPSS20.0 系统软件进行统计处理。计量资料用均值±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用LSD-t 检验，组内比较采用配对t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔眼睫状体平滑肌细胞形态及鉴定

兔眼睫状体平滑肌细胞体外培养12 h 后，细胞开始贴壁，刚贴壁的细胞呈梭形，细胞相对较小，培养2 d 后，贴壁细胞增多，并逐渐伸展，原代细胞形态不一，多呈梭型，有少数细胞突起，呈单个生长或几个细胞以突起相连接（图1A）。

兔眼睫状体平滑肌细胞免疫组化鉴定：培养的睫状体平滑肌细胞为α-actin 免疫反应阳性，阳性物质位于胞浆内，呈棕黄色，胞核不着色；倒置显微镜下可见胞核无色，胞浆呈棕黄色（图1B）。

图1 兔眼睫状体平滑肌细胞形态及组化鉴定图。1A 原代兔睫状体平滑肌细胞形态图（×200）；1B 兔眼睫状体平滑肌细胞为αactin 免疫反应阳性（×400），阳性物质位于胞浆内，呈棕黄色，细胞核不着色

2.2 兔眼睫状体平滑肌细胞直径比较

给药前后比较：A组给药后所有时间点细胞直径较给药前均缩短，差异均有统计学意义（t0.5min=6.347，t1min=6.582，t2min=10.870，t4min=11.480，t10min=5.005，均P=0.000）。B组给药后所有时间点细胞直径变化均无统计学意义（P＞0.05）。C组给药后4、10 min 细胞直径均伸长，差异均有统计学意义（t4min=2.086，P=0.039；t10min=2.300，P=0.024）；余时间点细胞直径变化均无统计学意义（P＞0.05）。D组给药后1、2、4、10 min细胞直径均伸长，差异均有统计学意义（t1min=2.794，P=0.006；t2min=3.294，P=0.001；t4min=3.109，P=0.003；t10min=2.821，P=0.006）；给药后0.5 min 细胞直径变化无统计学意义（P＞0.05）。E组给药后2、4、10 min 细胞直径均伸长，差异均有统计学意义（t2min=2.389，P=0.019；t4min=3.271，P=0.002；t10min=3.983，P=0.000）；余时间点细胞直径变化均无统计学意义（P＞0.05）。F组给药后所有时间点细胞直径变化均无统计学意义（P＞0.05）。G组给药后所有时间点细胞直径变化均无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

组间比较：与A组给药后各时间点比较，B～G组细胞直径均伸长，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与B组给药后10 min 比较，E组细胞直径缩短，差异有统计学意义（P＜0.05），余组均无统计学意义（P＞0.05）；与余时间点比较，C～G组细胞直径变化均无统计学意义（P＞0.05）。与C组给药后0.5 min 比较，E组细胞直径缩短，差异有统计学意义（P＜0.05），余组均无统计学意义（P＞0.05）；与给药后1 min，D、G组细胞直径伸长，差异有统计学意义（P＜0.05），余组细胞直径变化均无统计学意义（P＞0.05）；与余时间点比较，D～G组细胞直径变化均无统计学意义（P＞0.05）。与D 给药后10 min 比较，E组细胞直径伸长，差异有统计学意义（P＜0.05），余组均无统计学意义（P＞0.05）；与余时间点比较，E～G组细胞直径变化均无统计学意义（P＞0.05）。与E组给药后0.5 min 比较，F组细胞直径伸长，差异有统计学意义（P＜0.05），G组细胞直径变化无统计学意义（P＞0.05）；与余时间点比较，F、G组细胞直径变化均无统计学意义（P＞0.05）。与F组给药后2 min 比较，G组细胞直径伸长，差异有统计学意义（P＜0.05）；与余时间点比较，G组细胞直径变化均无统计学意义（P＞0.05）（表2、3）。

表2 不同浓度目舒丸溶液干预前、后兔眼睫状体平滑肌细胞直径比较（，n=3，μm）

表2 不同浓度目舒丸溶液干预前、后兔眼睫状体平滑肌细胞直径比较（，n=3，μm）

注：* 与同组组给药前比较，P＜0.05；# 与A组比较，P＜0.05；△与B组比较，P＜0.05；○与C组比较，P＜0.05；◇与D组比较，P＜0.05；▲与E组比较，P＜0.05；●与F组比较，P＜0.05

表3 不同浓度目舒丸溶液干预后各时间点兔眼睫状体平滑肌细胞直径统计值

2.3 兔眼睫状体平滑肌细胞内PKC 及RhoA 基因表达

与H组比较，I组的PKC 及RhoA 表达量降低，差异均有统计学意义（tPKC=-3.566，P=0.023；tRhoA=-8.895，P=0.001）（表4）。

表4 RT-PCR 检测结果（，n=3）

表4 RT-PCR 检测结果（，n=3）

3 讨论

中医将视疲劳归于“肝劳”，肝血耗损、过度使用脑力及目力，都会导致目窍失养，无法久视。调节痉挛是视疲劳的常见原因，现代工作方式造成调节痉挛发生的普遍性，但临床除了屈光矫正，并无有效治疗方法。

目舒丸为中国中医科学院眼科医院庄曾渊教授多年经验方加工而成，治疗眼视疲劳，症见眼珠隐痛、头额闷痛、不能久视、视力模糊、常欲闭目，临床疗效较好。本实验设定了6 个时间水平，考察7 个目舒丸剂量梯度来观察其对眼睫状体平滑肌细胞舒缩作用时间、剂量效应关系，及对睫状体平滑肌细胞内与收缩有关的钙依赖性及非钙依赖性信号传导因子的影响。

原代培养的兔睫状体平滑肌细胞具有很好的收缩功能，是研究睫状体生理及药理作用的良好实验材料。本研究采用组织胶原酶消化法成功获得原代兔睫状肌细胞，细胞呈梭形，α-actin 染色强阳性，与已有国外文献一致[6-7]。原代睫状体平滑肌细胞给予不同浓度目舒丸干预一定时长后发现，目舒丸可显著影响睫状肌细胞的收缩状态，并呈现一定的时间依赖性，尤其是1.0 mg/mL 目舒丸干预细胞10 min内，发现其能显著舒张平滑肌。

RhoA 是单体G 蛋白中结构较为保守的蛋白，其C 端可以参与正确定位蛋白与翻译后的修饰，N 端则具有可以与鸟苷三磷酸（guanosine-5′-triphosphate，GTP）结合并参与水解的大部分氨基酸[8]。RhoA 结构中存在具有催化功能的氨基酸，这些氨基酸主要在GTP 水解过程中发生作用。肌动蛋白聚合受到RhoA 蛋白的影响，促使细胞粘附，肌动球蛋白收缩等。目前，参与细胞动力学的重要信号通路是RhoA-ROCK[9]。RhoA 激活Rho 相关激酶，促进细胞粘附、改变细胞形态以及促使细胞骨架拉伸，Rho 激酶（Rho-associated kinase，ROCK）活化状态持续，激活肌球蛋白轻链磷酸化会促使ROCK 进一步拉伸细胞骨架，同时加强RhoA-ROCK 的耦合。ROCK 激活可以促使肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）磷酸化而产生肌丝收缩作用，同时活化后ROCK 的底物是磷酸化肌球蛋白轻链激酶（myosin light-chain phosphatase，MLCP）。磷酸化是在接受Rho/ROCK 的活化信号后产生的，失活后，同时也使磷酸化的MLC 脱磷酸失活状态的终止，从而提高胞浆内磷酸化MLC 水平，增加肌球-肌动蛋白交联。在钙水平相同的条件下，MLC 磷酸化的程度增加，细胞收缩强度增加，说明收缩蛋白对钙的敏感性的增加，这一过程称为钙敏感性调节。

PKC 是一种存在于胞质的依赖钙和磷脂酶的蛋白激酶，其活性影响着细胞的增殖、凋亡等生物学活动[9]。另外，PKC 可以通过p44/42MAPK 信号级联反应使钙黏蛋白（cadherin，CaD）和P-钙粘蛋白（Pcadherin，CaP）发生磷酸化，促使它们对肌球蛋白ATP 酶活性的抑制作用消失，从而调节平滑肌细胞的收缩[10-11]。

本研究发现，在加入氯化乙酰胆碱24 h 前加入目舒丸，发生作用后，与单纯加入氯化乙酰胆碱组相比，细胞内PKC 及RhoA 表达量下降，推测目舒丸可通过降低睫状体平滑肌细胞内PKC 及RhoA 的表达，减少非钙依赖通道引起的睫状体平滑肌细胞收缩，进而改善睫状体平滑肌过度收缩引起的眼部调节功能异常。

综上，本研究发现目舒丸可通过降低睫状体平滑肌细胞内PKC 及RhoA 的表达，减少非钙依赖通道引起的睫状体平滑肌细胞收缩，进而改善睫状体平滑肌过度收缩引起的眼部调节功能异常。