基于网络药理学探讨启明丸控制近视进展的作用机制

蒋飘，宿蕾艳，庄曾渊，杨永升，张莎莎，夏秋芳，亢泽峰，臧玉玲

近视是眼在调节放松的状态下，平行光线经屈光系统折射后，焦点落在视网膜之前的一种屈光状态[1]。目前近视患病率逐年攀升，已成为世界上视力受损的主要原因[2]，预计到2050 年，全球近视患病率将上升至49.8%，其中9.8%为高度近视[3]。我国作为近视大国，近视人群达7 亿[4]，青少年近视患病率稳居全球最高[5]，青少年视觉健康状况下降在影响其学习、生活与择业的同时，也影响到了我国的国际竞争力。因此，我国在2018 年就将青少年近视防控上升为国家战略[6]。

本病在中医亦称为近视，中医认为五脏六腑之精气皆上注于目，眼病的发生与五脏六腑都相关。当前近视多发主要是用眼过度，以致心阳温煦不及，目窍不通，神光不得发越于远处，从而导致近视的出现。明代龚廷贤[7]认为：“目能近视，而不能远视，有水而无火也。法当补心，定志丸加茯苓主之”。在《一草亭目科全书》[8]中亦载有“定志丸，治目能近视不能远视”。启明丸是庄曾渊研究员在定志丸的基础上，结合自己的临床经验以及当前近视发病的特点，加郁金、丹参以化瘀行气，加黄精、山药以补虚养神，诸药合用，共奏补益心脾，益气养血，开窍明目的功效，主要用于控制青少年近视的进展。启明丸作为院内制剂，在本院临床应用已有20 余年，费永彪[9]的研究明确了启明丸对豚鼠近视进展干预的有效性。本文旨在基于网络药理学、生物信息学进一步探讨启明丸控制近视进展的可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 启明丸有效成分的筛选和靶点预测

运用中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine systems pharmacology data-base and analysis platform，TCMSP）、（Traditional Chinese Medicine integrative database for herb molecular mechanism analysis，TCMID）收集启明丸中人参、茯苓、山药、远志、石菖蒲、丹参、郁金、黄精的化学成分，根据药代动力学参数筛选有效成分后，下载其mol2 结构式，经过open babel 2.4.1 转化并保存各化合物SMILES 结构式，利用SwissTargetPrediction进行药物的靶点预测。

1.2 近视疾病靶点收集

以“myopia”作为关键词，通过已知疾病靶点数据库对其作用靶点进行查询。查询的已知疾病数据库有Genecards、TTD、Drugbank、DisGeNET、OMIM、PharmGKB。删除重复靶点，得到已知近视的作用靶点。

1.3 启明丸有效成分与潜在靶点网络构建

为找出启明丸控制近视进展的有效成分及作用靶点，可通过Venny2.1.0 得到启明丸的化学成分靶点与近视靶点的交集，将筛选出的靶点和对应的有效成分导入Cytoscape3.7.1 软件中构建网络图。

1.4 PPI 网络的构建及核心靶点的筛选

根据上一步骤得到的启明丸的化学成分靶点与近视靶点的交集，利用STRING 数据库，构建蛋白互作网络（PPI scores＞0.4）。将筛选后的靶点导入到Cytoscape3.7.1 软件中进行可视化分析，利用自由度（Degree）、介度（Betweenness）、紧密度（Closeness）3个拓扑参数（在网络中发挥关键作用）进行筛选，以同时不低于这3 个值的中位数作为筛选条件，进一步筛选核心靶点，构建药物靶点-疾病靶点相互作用网络。

1.5 GO 功能富集分析

将获取到的核心靶点使用DAVID 数据库进行GO 功能富集分析、KEGG 通路富集分析，解析启明丸的潜在作用机制。

2 结果

2.1 启明丸化学成分靶点分析结果

经TCMSP 数据库检索并以OB≥30%和DL≥0.18 作为筛选条件，收集到启明丸中各中药有效成分为人参22 种、茯苓15 种、山药16 种、黄精12 种、郁金15 种、丹参65 种、石菖蒲4 种；基于TCMID 数据库共收集到远志79 种成分。

利用SwissTargetPrediction 对上述化学成分进行靶点预测，根据Probability≥0.15 筛选靶点，删除重复值后，共得到启明丸作用靶点197 个。

2.2 近视相关作用靶点分析结果

近视作用靶点的检测可以通过检索疾病相关靶点数据库进行收集。Genecards、TTD、Drugbank、DisGeNET、OMIM、PharmGKB 是国际上公认的疾病靶点检测数据库，本文通过分别检索以上数据库得到近视相关作用靶点，分别检索到4559、2、1、333、47、11 个靶点。删去重复靶点，得到4586 个近视相关作用靶点。

2.3 启明丸控制近视进展的有效成分

将启明丸化学成分靶点与近视的疾病靶点共同导入到Venny2.1.0 中，获取两者的交集共有80 个靶点（图1）。根据这80 个靶点共找出启明丸控制近视进展的化学成分47 个，利用Cytoscape3.7.1 软件中构建启明丸有效成分-靶点网络图（图2）。通过分析网络，药物成分中MOL000422（山奈酚）自由度为99，介度为0.26180257，紧密度为0.4751773，预测山奈酚为启明丸控制近视进展的主要成分；其次为MOL000006（木犀草素）（自由度为49，介度为0.25839337，紧密度为0.4751773）、MOL006331（4′,5二羟基黄酮）（自由度为30，介度为0.09095026，紧密度为0.39181287）、MOL002714（黄芩素）（自由度为24，介度为0.08271159，紧密度为0.38953488），其中山奈酚为人参、石菖蒲共有成分，木犀草素为丹参的成分，4′,5 二羟基黄酮、黄芩素为黄精的成分，揭示了中药复方多成分协同作用的特点。

图1 启明丸与近视交集靶点

图2 启明丸有效成分-靶点网络图

2.4 蛋白互作网络的构建及核心靶点的筛选

将上述交集的80 个靶点导入到STRING 数据库中进行蛋白质相互作用分析（PPI），根据蛋白质相互作用得分（PPI score＞0.4），初步筛选关键靶点蛋白，然后导入Cytoscape3.7.1 中进行蛋白质互作网络构建，通过Network Analyzer 插件对网络的拓扑性质进行分析。同时取Degree，Betweenness centrality，Closeness3 个拓扑参数的中位数为阈值（分别为7，0.0031，0.4405），最终获得27 个相互作用的核心靶点，分别为AKT1、EGFR、SRC、STAT3、ESR1、APP、KDR、AR、PIK3R1、MMP9、PPARG、MMP2、EZH2、ABCB1、GSK3B、KIT、NTRK2、IGF1R、TERT、PTPN11、CYP19A1、CDK5、AHR、BACE1、AKR1B1、DRD4、ACHE（图3、4）。

图3 启明丸靶点与近视靶点的相互关系图

图4 核心靶点的蛋白互作图

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

利用DAVID 在线平台对PPI 网络中的关键靶点进行GO 功能富集分析，共确定了220 个GO 条目，每类选取富集程度排序最高的前20 条。结果显示，在生物过程中，这些基因主要涉及在蛋白质磷酸化、炎症反应、DNA 复制、细胞增殖、细胞凋亡过程等方面（图5）。在分子功能中主要涉及受体结合、转录因子结合、酶结合、蛋白质结合、激酶活性等（图6）。在细胞成分中主要涉及质膜、细胞质、内体、突触后膜、受体复合物、核染色质、高尔基体等（图7）。

图5 关键靶点的GO 富集-生物过程

图6 关键靶点的GO 富集-分子功能

图7 关键靶点的GO 富集-细胞组分

对核心靶点进行KEGG 通路富集分析，共确定了作用通路76 条，筛选前20 条进行分析，结果发现与这些靶点关联密切的通路有，雌激素信号通路、催乳素信号通路、甲状腺激素信号通路、神经营养素信号通路、低氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor,HIF-1）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（Phosphatidylinositide 3kinases-proteinkinaseB，PI3K-Akt）信号通路、Rap1信号通路、Ras 信号通路、ErbB 信号通路、FoxO 信号通路、如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路等（图8）。

图8 关键靶点的KEGG 富集通路分析

3 讨论

近年来近视的发病率逐年上升，近视防控方法也越来越多样化，中药及其复方在影响近视发病的作用及机制受到广泛关注。启明丸已临床应用20 余年，在控制近视进展方面取得较好成效。本研究共筛选出启明丸与近视相关的作用靶点80 个。通过蛋白互作关系分析得到了MMP2、MMP9、STAT3、IGF1R、EGFR 等27 个靶点，这些即可能是启明丸控制近视进展的关键靶点。

基因金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一种Ca2+、Zn2+依赖型酶家族，几乎能降解细胞外基质（ECM）中的各种蛋白成分。研究[10]表明，基因金属蛋白酶2（MMP2）和基因金属蛋白酶9（MMP9）主要降解Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原及弹性蛋白，而巩膜组织主要由Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原组成，因此，当MMP2、MMP9 表达增加可能会导致巩膜胶原降解增加，眼球的抗张力下降，进一步可使得眼轴变长。信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在Janus 激酶/信号转导与转录激活子（Jak/Stat）信号转导途径中起着关键作用，晶状体、脉络膜、视网膜组织中均有这一家族成员的分布[11-12]。近视信使如生长素、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、视黄酸等与视网膜色素上皮或脉络膜等细胞结合后能激活或抑制这些细胞STAT3 蛋白的活化与表达，通过STAT3 信号转导通路,调节其下游的某些特定靶基因的表达，VEGF、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、MMP2 等作用于巩膜,促进后极部巩膜细胞的增生与分化及巩膜细胞外基质的重塑而产生近视[13]。胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）是一类结构上与胰岛素相似的多肽,主要作用于细胞生长、增殖、分化、成熟及再生等方面；IGF-1R 是IGF 系统的重要成员。研究[14]表明，IGF1 和IGF1R结合后,可能通过生长因子-受体信号级联效应激活静止态的G0/G1 期细胞向S 期转变，使DNA 合成量增加，从而促进豚鼠巩膜成纤维细胞的增殖。表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR 信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR 与表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）结合后通过影响通路中相关因子的活性促进视网膜色素上皮细胞和巩膜细胞的增殖[15]。

为了进一步研究启明丸控制近视进展的机制，了解核心基因在基因功能和信号通路中的作用，本研究进行了G0 生物学功能富集分析，发现影响的生物学过程主要集中在细胞增殖分化、细胞凋亡、蛋白质磷酸化、炎症反应、DNA 复制、转录因子结合、酶结合等方面。在靶点基因的KEGG 通路富集分析中，可以发现磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路、雌激素信号通路、甲状腺激素信号通路、HIF-1 信号通路富集程度较高，与近视关系密切。

其中，PI3K-Akt 信号通路是胰岛素的重要下游通路，与细胞增殖和凋亡、葡萄糖转运有关。研究表明，胰岛素有强大的促近视作用(主要是由于其对眼前段光学的影响)[16]，胰岛素受体能激活PI3K-Akt信号通路[17]，PI3K 催化产生的产物能够激活核转录因子激活蛋白-1（activatorprotein 1,AP1）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）等，参与调控巩膜重塑等近视发生的多种生物过程[18]。

雌激素信号通路主要通过雌激素与雌激素受体（estrogen receptor,ER）结合而调节基因表达以发挥作用，新陈代谢、炎症反应、心肌细胞存活等疾病过程受到雌激素和ER 结合后激活的细胞质中的激酶或细胞核中的基因转录的调节[19]。研究[20]表明，视黄酸（retinoic acid,RA）能明显抑制人巩膜成纤维细胞的生长，雌激素能够激活或者抑制AP1 依赖的转录，而AP1 和转化生长因子-β2（transforming growth factor-β2,TGF-β2）能够通过视黄酸信号通路调控豚鼠近视的形成[21-22]。此外，PI3K 信号通路可由雌激素和细胞膜上的ER 结合而激活[23]，进而通过影响巩膜重塑而控制近视进展。

甲状腺信号通路是甲状腺功能的重要组成部分，甲状腺激素（thyroid hormone,TH）可以通过调节发育中的视网膜中s 视蛋白和m 视蛋白的比率而影响视力。当TH 与甲状腺激素受体β2（thyroid hormone receptor β2,TRβ2）结合后会抑制s 视蛋白并激活m 视蛋白[24]。在视网膜中TRβ2 仅限于视锥细胞感光细胞，研究表明TRβ2 是视锥细胞晚期分化的关键调节因子。此外，三碘甲腺原氨酸（3,5,3′-triiodothyronine,T3）可通过作用于视网膜前体细胞影响视锥细胞的分化，同时M 视蛋白及S 视蛋白的表达也受到T3 的影响[24-25]。以上结果显示，甲状腺激素能够调控视锥细胞的分化和视蛋白的表达，从而影响近视进程。

HIF-1 是细胞内对低氧敏感的因子之一，是由两个基本的螺旋-环-螺旋PAS（Per-ARNT-Sim）蛋白缺氧诱导因子1-α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）和缺氧诱导因子1-β（hypoxia inducible factor-1β，HIF-1β）组成的异二聚体。研究发现，HIF-1α 可通过肌成纤维细胞转分化促进近视的发生[26]，HIF-1α 在介导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化过程中发挥了重要作用，导致巩膜重塑从而影响近视发展。

综上所述，本研究通过网络药理学方法探讨启明丸控制近视进展的主要机制，发现启明丸作用于MMP2、MMP9、STAT3、IGF1R、EGFR 等关键靶点，通过PI3K-Akt 信号通路、雌激素信号通路、甲状腺激素信号通路、HIF-1 信号通路等重要通路，影响巩膜重塑、视锥细胞分化和视蛋白合成等过程发挥控制近视进展的作用。由于数据库不完善、检索不全面、分析不透彻等主客观因素，使得本研究存在一定的局限性，仍需要进一步的深入研究。