益景汤对糖尿病大鼠血-视网膜屏障的影响

刘光辉，张云辉，郑永征，潘铭东，孟春，徐朝阳

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最为常见的微血管并发症之一，是全球主要的不可逆性致盲性眼病，需要进行早期防治。血-视网膜屏障（blood-retinal barrier,BRB）损害是DR 的早期表现，是DR 发生、发展的关键[1]。BRB 损害是目前DR 早期防治研究的热点。益景汤（原名加味补阳还五汤）是福建中医药大学附属人民医院眼科针对DR 气阴两虚夹瘀病机设计用于DR 早期防治的验方。既往临床研究中观察到益景汤能够改善DR 患者视网膜微循环、减轻黄斑水肿[2-3]，基础研究中显示益景汤能够抑制DM 大鼠BRB构成细胞的凋亡、减缓视网膜毛细血管的减少[4-5]。本次研究采用益景汤干预DM 大鼠，观察了其对视网膜微血管渗漏性及BRB 紧密连接相关蛋白表达的影响，探讨了益景汤用于DR 早期防治的效应及机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性清洁级6 周龄SD 大鼠45 只，屈光间质透明，体重200±20 g，购买自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005。饲养于21～25℃环境，相对湿度为50%～55%。普通颗粒饲料喂养，自由饮水，12 h／12 h 明暗交替光照。实验动物的处理按国家科学技术委员会1988 年颁布的《实验动物管理条例》执行。

1.2 药物、主要试剂及仪器

益景汤（黄芪15 g、山药15 g、苍术9 g、桃仁5 g、红花5 g、当归9 g、川芎6 g、赤芍10 g 等），每剂浓煎至50 mL 备用，由福建中医药大学附属人民医院药剂科；链脲佐菌素（streptozotoci，STZ）购于美国Thermo Fisher 公司；抗封闭蛋白（occludin）抗体、抗连接蛋白5（claudin-5）抗体、抗闭锁连接蛋白1（zonula occludens 1，ZO-1）抗体购自美国abcam 公司；伊凡思蓝（evans blue，EB）购自上海生工生物公司；倒置荧光显微镜（TE2000-S）购自日本Nikon公司。

1.3 分组及模型制作

45 只SD 大鼠按简单数字随机法分为3组：正常组、DM组、益景汤组，每组15 只。除正常组外，其余2组大鼠被制成DM 模型。临用前以0.1 mmol/L、pH4.5柠檬酸缓冲液溶解STZ，配置成1%溶液。将大鼠禁食12 h 后，按60 mg/kg 剂量于左下腹腔内一次性注射STZ。正常组注射同等剂量的柠檬酸盐缓冲液。72 h后取尾血测血糖，血糖≥16.7 mmol/L 大鼠为造模成功。造模成功后每周监测血糖1 次，观察大鼠一般状况。

1.4 干预方法

益景汤组予益景汤水煎液灌胃，按方剂饮片合剂量10.71 g／（kg·d）计算，取原药煎液1.35 mL，加蒸馏水稀释至3 mL，一次性灌胃，每日1 次。DM组和正常组采用PBS 缓冲液3 mL 灌胃，每日1 次。干预自造模成功后开始持续至16 周末。干预结束后，麻醉处死大鼠，摘取眼球，按下述蛋白免疫印迹法（western blotting，WB）要求提取蛋白。

1.5 EB 活体灌注视网膜铺片

大鼠麻醉后，于尾静脉注射5%EB 染色液1 mL，直至大鼠通体变蓝，处死大鼠摘取眼球，4%多聚甲醛中固定4 h，在体视显微下剪开角膜缘，分离出视网膜，剪成4 瓣展开平铺于载玻片上，抗荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜460 nm 波长激发光下观察EB渗漏情况。

1.6 WB 法检测occludin、claudin-5、ZO-1 蛋白的表达

提取各组大鼠视网膜组织，加入含有RIPA 裂解液对视网膜组织进行匀浆。匀浆结束后离心、定量，制备蛋白上样品。行SDS-PAGE 电泳、转膜、封闭、抗体孵育及显影。采用Gel-Pro Analyzer 4 分析条带光密度值，获取目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法

采用GraphPad 6 进行数据处理，计量资料采用均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析进行比较，两两比较采用LSD-t 检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 视网膜微血管渗透性

在16 周末，正常组大鼠无明显BRB 损害，镜下见视网膜微血管管径均匀、管迹清晰，未见明显荧光渗漏（图1A）。DM组大鼠存在明显的BRB 损害，镜下见视网膜微血管管径欠均匀、管迹模糊、局灶性扩张，存在节段性中小血管荧光渗漏及广泛的毛细血管荧光渗漏，未见毛细血管无灌注区（图1B）。益景汤组大鼠存在轻度BRB 损害，镜下见大部分视网膜微血管管径均匀、管迹清晰，少量毛细血管局灶性扩张，节段性中小血管荧光渗漏及少量的毛细血管荧光渗漏，未见毛细血管无灌注区（图1C）。

图1 各组视网膜微血管渗透性。1A 正常组，视网膜微血管管径均匀、管迹清晰，未见明显荧光渗漏；1B DM组，视网膜微血管管径欠均匀、管迹模糊、局灶性扩张，节段性中小血管荧光渗漏及广泛的毛细血管荧光渗漏；1C 益景汤组，大部分视网膜微血管管径均匀、管迹清晰，有节段性中小血管荧光渗漏及少量的毛细血管荧光渗漏。DM 糖尿病

2.2 视网膜occludin、claudin-5、ZO-1 蛋白的表达

occludin：DM组和益景汤组表达量均下降，3组间比较，F=285.300，P=0.000，有统计学意义。两两比较，正常组的表达量明显高于DM组（t=23.568,P=0.000）、益景汤组（t=16.068,P=0.000），而益景汤组高于DM组（t=5.539，P=0.000），均有统计学意义（表1）。

claudin-5：DM组和益景汤组的表达量均下降，3组间比较，F=116.791，P=0.000，有统计学意义。两两比较，正常组的表达量明显高于DM组（t=17.447,P=0.000）、益景汤组（t=8.422,P=0.000），而益景汤组高于DM组（t=5.466，P=0.000），均有统计学意义（表1）。

ZO-1：DM组和益景汤组的表达量均下降，3组间比较，F=198.236，P=0.000，有统计学意义。两两比较，正常组的表达量明显高于DM组（t=21.365,P=0.000）、益景汤组（t=13.329,P=0.000），而益景汤组高于DM组（t=3.325，P=0.008），均有统计学意义（表1）。

表1 各组大鼠视网膜中occludin、claudin-5 和ZO-1 蛋白的相对表达量（，n=5）

表1 各组大鼠视网膜中occludin、claudin-5 和ZO-1 蛋白的相对表达量（，n=5）

注：* 与正常组相较，P＜0.05；# 与DM组相较，P＜0.05。occludin封闭蛋白；claudin-5 连接蛋白5；ZO-1 闭锁连接蛋白1

3 讨论

DR 是临床常见的致盲性视网膜血管性疾病，视网膜微血管损害是DR 的重要病理表现[6]。在DR中，视网膜微血管损害的发生远早于肉眼可见的视网膜病变。视网膜微血管在长期代谢异常所致的缺血缺氧的环境下可出现内皮细胞和周细胞丧失、基底膜增厚及视网膜血流动力学变化等改变，直接表现为BRB 结构完整性的破坏及渗透性的增加[7]。

BRB 是一种生理屏障，具有调节离子、蛋白质和水进出视网膜的功能[8]。BRB 分为血-视网膜外屏障（outer blood-retinal barrier,oBRB）和血-视网膜内屏障（inner blood-retinal barrier,iBRB）2 种亚型。其中oBRB 由脉络膜毛细血管、视网膜色素上皮及细胞间的连接构成，iBRB 由内皮细胞、周细胞、基底膜及细胞间的连接构成。在正常生理状态下，BRB 屏障可以调控血管内液体和离子进入视网膜，阻止血细胞及蛋白质等大分子物质进入视网膜。在高糖、缺氧、炎症等病理条件下，细胞间连接可以受到破坏，BRB 渗透性增加，导致进入视网膜的液体过多及蛋白质等大分子物质异常渗漏，引起黄斑水肿。在临床中，黄斑水肿可以发生于含早期在内任何一期DR[9-10]。动物实验表明，1 个月期糖尿病模型大鼠即可以发生BRB 损害，出现视网膜血管渗漏[11]。

EB 可以检测BRB 的损害。EB 是一种生物染色剂，注射入血管后，可以与血浆白蛋白紧密结合。视网膜微血管正常时，BRB 可以阻止其透过血管渗漏到视网膜组织中。当BRB 发生损害时，通透性增加，EB 与白蛋白的复合物则可以渗漏到血管外，被观测到[12]。故可以用于BRB 损害的定量或者定性检测。本次研究观察发现16 周末的DM组大鼠视网膜微血管存在广泛的EB 渗漏，而益景汤组大鼠视网膜微血管渗漏程度轻，仅见节段性中小血管荧光渗漏及少量的毛细血管荧光渗漏，提示益景汤对DM 大鼠BRB 损害具有保护作用。为进一步验证益景汤对DM 大鼠BRB 保护作用的机制，研究检测了BRB 紧密连接相关蛋白的表达。

紧密连接又称闭锁小带，是BRB 细胞间多种连接形式中的一种，其广泛位于内皮细胞等细胞间隙的顶端，能机械连接相邻细胞，封闭细胞顶部的间隙，阻挡胞外蛋白质等大分子物质经细胞间隙进入组织内[13]。紧密连接本质是一种蛋白复合体，构成蛋白有occludin、claudin、ZO、连接粘附分子JAM 等[14]。其中occludin 及claudin 为跨膜蛋白，同时具有胞内环和胞外环，胞外环以“拉链”状结合封闭细胞间间隙，胞内环则与胞内ZO 蛋白形成网状结构的支架结合，参与维持和调节极性细胞的屏障功能[13]。claudin-5 广泛表达于BRB，是claudin 中的内皮细胞特异型，具有离子选择性。ZO-1 则常见于内皮细胞的闭锁小带中。结构蛋白是BRB 发挥屏障功能的物质基础，BRB 通过这些连接蛋白调控液体和分子的运动，维持视网膜的正常功能。当蛋白的表达量发生变化时，BRB 的通透性将会受到影响。

在早期DR 中，occludin、claudin-5、ZO-1等紧密连接相关蛋白的损伤是BRB 被破坏的核心因素之一。Leal 等[11]观察到Wistar 大鼠经STZ 造模成功后1 个月，视网膜组织中occludin、claudin-5、ZO-1蛋白表达即下降，BRB 通透性增加。雷晓琴等[15]发现SD 大鼠DM 造模成功后12 周，视网膜渗漏增加，occludin、ZO-1 蛋白的表达量较正常组减少了约50%。本次研究观察到16 周末DM组大鼠occludin、claudin-5、ZO-1 表达量下降，与既往研究结果类似。这一结果表明，可以干预BRB 损害来进行DR 早期防控。

目前已有很多针对DM 视网膜BRB 损害进行干预的药物研究，如抗VEGF 药物、糖皮质激素、重组人血管内皮抑素、促红细胞生成素及中医药等[15-18]。这些研究结果均证实，增加occludin、claudin-5、ZO-1等紧密连接相关蛋白的表达量，可以实现BRB 的保护效应。益景汤是福建中医药大学附属人民医院眼科针对DR 气阴两虚夹瘀病机设计用于DR 早期防治的验方，由补阳还五汤化裁而来，具有益气养阴、通络明目之效果。既往临床中观察到益景汤能够改善DR 患者视网膜微循环、减轻黄斑水肿[2-3]，基础研究中观察到益景汤能够抑制DM 大鼠视网膜微血管周细胞凋亡、减缓视网膜毛细血管的减少[4-5]。本次研究观察到益景汤能够抑制DM 所引起的视网膜组织中occludin、claudin-5、ZO-1 等紧密连接相关蛋白表达量的下降，表明益景汤减轻DM 大鼠视网膜微血管渗漏的作用机制与其抑制上述蛋白的表达量下降、保护BRB 有关。

综上所述，BRB 损害是早期DR 的重要特征，益景汤能够抑制DM 大鼠视网膜组织中occludin、claudin-5、ZO-1 等紧密连接相关蛋白表达量下降，降低BRB 的损害，减轻视网膜微血管的渗漏，对早期DR 具有防治作用。