蛹虫草退化菌株的研究进展

周 影 王 芹 张俊辉 刘 娟 钱 琨 王大雨

(吉林省蚕业科学研究院，吉林吉林 132000)

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)又称北冬虫夏草，主要寄生在鳞翅目、鞘翅目等昆虫蛹体上的真菌，属子囊菌亚门，麦角菌科，虫草属。蛹虫草含有虫草素、虫草多糖、喷司他丁、麦角甾醇等多种活性成分[1]，在抗肿瘤、增强免疫力、抗菌抗炎等方面具有很好的药理作用[2]。由于其多种生理活性，在国内外广泛用作天然药物和民间滋补食品[3]。它与野生的冬虫夏草的活性成分、营养价值及药用功能均非常相似，并且已经实现工厂化生产，价格相对较低，是野生冬虫夏草的最佳替代品。2009年，中华人民共和国卫生部将蛹虫草列为新资源食品，2019年入选《中华人民共和国农业植物品种保护名录(第十一批)》，是一种具有广阔市场前景的食用药菌。

但是，蛹虫草菌株在继代培养和保藏过程中非常容易退化[4]，菌株退化会导致子实体畸形、变少、甚至不产生子实体[5]，降低了子实体品质和产量，带来巨大经济损失，影响蛹虫草行业的发展。蛹虫草菌株的退化是蛹虫草行业持续发展亟待解决的关键问题。本文对蛹虫草退化后生物学特征的变化，引起退化的外界因素、自身遗传因素和防治措施作一综述，以期对今后蛹虫草菌株的退化研究有所启发，为蛹虫草退化菌株的甄别提供依据。

1 蛹虫草退化菌株的概况

1.1 形态特征

大多数丝状真菌，经多次继代培养后，菌株会出现退化的现象。菌株的退化时，其菌落形态会发生变化，主要表现在菌落发生角变，在培养基上出现扇形、半月形和放射形等形状，其中以扇形为主，菌落的边缘出现白色绒状的角突变[6]，如图1。

A正常菌株菌落；B角变菌株菌落；C退化菌株菌落

蛹虫草菌株在发生退化时，其菌落颜色也会发生变化。菌落颜色由橙色变成杏黄色或者由杏黄色变成淡柠檬色及白色，颜色逐渐变浅。并且，退化菌株出现见光后转色慢或不转色现象，有时会出现黄色渗出液[7]。退化菌株的菌丝体形态也会发生变化，用显微镜观察蛹虫草退化与未退化菌株的菌丝，未退化菌株的菌丝粗壮挺立、分生孢子表现为念珠状；而退化的菌丝较细，呈弯曲交错状，分生孢子聚集在一起成头状[8]。

1.2 理化性质

蛹虫草退化菌株的生长速度变慢，产孢能力降低[9]，菌丝生长速度整体呈下降趋势。与正常菌株相比，退化菌株的纤维酶活性、淀粉酶活性、过氧化氢酶、脱氢酶等活性降低，以及胞外多糖含量也出现了降低[10]。

蛹虫草退化菌株的脱色能力降低。MAGAE等[11]和刘洋等[12]研究发现在加入BTB(溴麝香草酚蓝)的液体培养基中，退化菌株脱色能力相对较差，与未退化菌株相比，退化菌株的脱色率下降、液体培养基的pH升高。

2 蛹虫草菌株退化机理

蛹虫草菌株发生退化原因主要包括遗传变异和外界环境的原因，其中遗传变异引起退化的决定性因素。

2.1 环境因素

在生产中，生长子实体优良的蛹虫草菌株，随着菌株无性繁殖转管次数的增加，保藏时间的加长，保藏温度的差别，保藏培养基成份的差异，菌株都会出现不同程度的退化现象[13]，光照、湿度等因素也会对菌株产生影响。矿质元素对蛹虫草菌株退化有影响，如Mn2+和Mg2+会加速蛹虫草等的退化[14]。保藏方法对蛹虫草退化有重要影响，蛹虫草菌株在4 ℃保藏超过2个月，子实体产量开始下降；菌株传代次数超过3代，开始出现退化现象[15]。光照对蛹虫草菌丝生长产生抑制作用，长时间光照会导致气生菌丝不发达，引起菌株退化[16]。

2.2 遗传因素

2.2.1 交配型分析

蛹虫草是一种由交配型基因控制的有性生殖的异宗真菌。汪虹等[17]研究发现，蛹虫草的正常菌株同时含有MAT-HMG(MAT1-2-1)和MAT-alpha(MAT1-1-1和MAT1-1-2)两种交配型基因，为异核体，这种情况才能进行有性生殖，形成子实体；退化菌株只含有MAT-HMG或MAT-alpha其中一种交配型基因，为同核体，只能进行无性生殖，不能形成子实体，由此推断核相的改变可能是导致蛹虫草退化的原因。然而，另一研究表明，只含一种交配型基因或者两种交配型基因的蛹虫草菌株可以产生子实体，而同时含有两种交配型基因的蛹虫草菌株则不能产生子实体[18]。两者研究结果相反，可能是由于交配型产生偏分离造成的，不同交配型的孢子和菌丝生长能力不同，在多次无性繁殖后，产生偏分离现象，所以导致研究结果产生差异[19]，对于交配型的改变是造成退化的原因，还需进一步研究。

2.2.2 碱基变异分析

食用菌细胞分裂周期短、生长速度快，以及无性繁殖的无限性，这都加大了碱基发生变异的几率，从而导致菌株发生退化。Yin等[20]对蛹虫草的配型基因和ITS1+5.8S+ITS2、28S、18S进行分析，研究发现蛹虫草发生退化后ITS1+5.8S+ITS2、28S区域未发生变化，但是18S区域发生了7处碱基突变；其交配型基与野生型菌株相比，MAT1-1-1片段发生了3处碱基突变，但未影响氨基酸序列，MAT1-1-2片段在发生1处碱基突变，使氨基酸发生改变，从甘氨酸变为缬氨酸，这些碱基变异导致不能形成子实体；同时CmMAT1-1-1和CmMAT1-1-2基因的表达显著下调至7.5%和4.4%。蛹虫草正常菌株和其退化菌株的ITS 区域碱基序列进行分析比较，发现退化菌株的ITS序列中有个别碱基位点发生了变化，说明这两者在DNA水平产生了明显的遗传变异，这种变异可能与蛹虫草菌株退化相关[8,21]。

2.2.3 光受体基因分析

有研究表明，蛹虫草菌种光受体基因Cmwc-1和Cmcry-DASH的缺失可能与退化现象存在一定关系。光对于蛹虫草子实体的生长至关重要，Cmwc-1基因与Cmcry-DASH都是蛹虫草蓝光受体基因，将正常的蛹虫草菌株敲除Cmwc-1和Cmcry-DASH基因后，ΔCmwc-1菌株的菌丝见光后不变色，ΔCmwc-1菌株也没有形成原基和子实体；ΔCmcry-DASH菌株可以形成原基，但子实体矮小，生长周期变长[22]。所以，若蛹虫草菌株光受体基因受损，将造成蛹虫草质量和产量下降，出现退化现象。

2.2.4 转录组分析

近年来，转录组测序在真菌抗逆性和退化方面研究越来越多。通过组织分离的菌株具有很多类型的菌丝，不能确保菌源来源的同一性。冯玉杰[23]以单分生孢子进行继代培养，将第1代、第3代和第5代杂交原基形成阶段进行转录组分析，共发现3 229个显著差异表达基因，严重退化菌株中有2 346个DEGs，从结果看来，第3代是菌株退化的节点，且随着蛹虫草菌株的退化，差异表达基因的数目也逐渐增多。DEGs在生物过程中的GO富集大部分表现在跨膜转运过程，以及表现在毒素生物合成过程和代谢过程、霉菌毒素生物合成过程和代谢过程、次生代谢产物生物合成过程和次生代谢过程，这说明菌株退化可能与这些生物过程有关。通过对比正常菌株与退化菌株，DEGs在分子功能中的GO富集主要表现在四吡咯结合、血红素结合和铁离子结合等，以及表现在转运活动、辅酶结合、跨膜转运蛋白活性、黄素腺嘌呤二核苷酸结合、蛋白质-精氨酸脱亚胺酶活性、丝氨酸型内肽酶活性、信息素受体活性、G蛋白偶联受体活和G蛋白偶联肽受体活性等，由此可见，菌株发生退化可能与这些过程有关。对筛选得到的DEGs进行KEGG富集分析发现，蛹虫草菌株的退化可能与氨基糖和核苷酸糖的代谢、酪氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、谷胱甘肽代谢和苯丙氨酸代谢、次生代谢物的生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、苯丙氨酸代谢、糖酵解/糖异生、抗生素的生物合成、谷胱甘肽代谢等代谢通路有关系。

2.3 胞内有害物质的累积

在生物体的生长发育的过程中，氨基酸起到重要的作用，不但给生物体提供必须的氮源，合成生物体的组织蛋白，也还参与酶、激素、一部分维生素的合成，对生物体的生理代谢过程有着重大影响。在苯丙氨酸和酪氨酸代谢过程中，铜胺氧化酶家族基因催化伯胺类物质转化为相应的醛，同时产生过氧化氢和氨，导致蛹虫草菌株内活性氧的增加[24]。活性氧(ROS)的细胞积累对蛹虫草菌株的退化有直接影响，生物体内的活性氧平衡通过谷胱甘肽、氧化氢酶等体系维持，其中的谷胱甘肽具有超强的清除自由基和抗氧化功能[25]。 Sun等[26]将构巢曲霉的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)克隆基因转化到产子实体菌株和退化菌株中进行过量表达，结果显示突变株具有更高的GPX活性和更强的清除细胞ROS的能力，退化菌株恢复产子实体能力，然而，在连续传代10次时，退化菌株的突变体再次发生退化，丧失了产子实体的能力，而正常菌株的突变体仍能稳定地产生子实体。这说明蛹虫草菌株的退化与细胞中ROS的累积相关。

3 菌株退化的防治措施

预防菌株退化的发生，可采取减少传代次数、4 ℃保藏菌种、选育优良菌种、菌种复壮等。在大规模生产中，尽量减少传代次数，传代次数不超过3次。蛹虫草菌种选择4 ℃保藏，产子实体的能力维持在1 a以上[27]。菌种复壮是最常用的方法来应对菌种退化，包括蚕蛹回接法、子囊孢子分离法、分生孢子分离法、基内菌丝分离法，实验证明前两种复壮效果较好[28]。改变培养基营养成分可延缓或恢复其退化现象，比如在培养基中添加组氨酸和赖氨酸[29]，及K+、Ca2+、Zn2+离子。选育优良菌株一直是应对退化的最佳方法，主要包括选育优良的蛹虫草进行组织分离，采用诱变的方式来筛选高产菌株等，还可以通过菌株杂交来获得高产菌株。另外，通过基因工程改造法，将谷胱甘肽过氧化物酶克隆基因转化到退化菌种中表达，可使退化菌种恢复产子实体能力。

4 总结与展望

上述研究表明，蛹虫草菌株在发生退化时，其生物学特征及理化性质会出现明显的变化，可以通过这些现象来甄别出退化菌株，从而降低生产的风险。目前对蛹虫菌株退化的研究主要集中在外界环境原因和遗传因素方面，其中遗传变异是导致菌种退化的决定性因素。蛹虫草退化的原因复杂，蛹虫草菌株退化的机制众说纷纭，到目前为止还未能定论。揭示蛹虫草菌株退化机制是从根本上解决菌株退化的前提条件，在未来研究中不仅要侧重利用基因组学和转录组学进行研究，探索碱基突变与退化的关系，找出差异基因进行功能研究等，还要在基因工程改造蛹虫草菌株方面进行钻研，选育克隆出稳定的菌种，从而彻底地解决菌株退化问题。