微生物发酵法脱除柞蚕蛹蛋白臭味和制备抗氧化肽的工艺研究

宫田娇 付 源 李 冰 周 影 王乐天 张世宇 杨淑芳*

(1.吉林省蚕业科学研究院，吉林吉林 132012；2.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118；3.德惠市园艺特产工作室，吉林长春 130300)

我国是世界上最大的蚕丝生产国，作为蚕丝生产的副产物，鲜蚕蛹年产量超过50万t，占世界总产量的70%以上[1]。蚕蛹的蛋白质含量在50%以上，远远高于一般食品，且蛋白质中的必需氨基酸种类齐全[2]。柞蚕蛹蛋白质由18种氨基酸组成，其中人体必需的8种氨基酸含量很高，比例适当，符合FAO/WHO(联合国粮农组织和世界卫生组织)的要求；蚕蛹也含有钾、纳、钙、镁、铁、铜、锰、锌、磷、硒等微量元素[3]，维生素A、E、B1、B2，胡萝卜素等[4]；蚕蛹中的不饱和脂肪酸的含量非常丰富，约占总脂肪的72.5%。此外，蚕蛹还具有很多药理作用：例如具有降低人的血清胆固醇的功能；对冠心病、动脉硬化、高血压、肝硬化和糖尿病有较好的防治作用[5]；柞蚕蛹蛋白肽还具有抗疲劳、抗氧化、抗衰老的功能；可用于治疗白血球减少症，急慢性、中毒性肝炎和生理衰退等病症[6]。

2020年月4月24日，Attaribo Thomas等[7]研究表明家柞蚕蛹蛋白(SPP)与花青苷-3- O-葡萄糖苷(C3G)的相互作用对花青素保护稳定性的影响。 2020年3月21日，Felix Manuel等[8]重点研究了从家蚕蛹中提取的蛋白浓缩物(SPC)的技术功能特性(界面和发泡特性)和体外抗氧化活性。2019年月1月30日，闵建华、王浩等[9]研究柞蚕蛹蛋白抗氧化活性肽的分离技术，并分析抗氧化活性肽的氨基酸成分等实验。2005年，赵鹏[10]以柞蚕蛹蛋白为原料，采用酶水解方法研究了蚕蛹活性肽。

近年来利用微生物发酵法除臭脱脂柞蚕蛹蛋白和制备抗氧化肽报道较少。本文采用微生物发酵法脱除柞蚕蛹蛋白臭味和制备抗氧化肽，并采用响应面优化了最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

菌种：副干酪乳杆菌(1.9089)、嗜热链球菌(1.1855)、青春双歧杆菌(1.2190)三种菌从中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)购置。

培养基：CGMCC提供培养基配方。摇瓶培养基[11]：全价脱脂柞蚕蛹蛋白粉50 g /L，121 ℃灭菌20 min。

1.2 材料与仪器

材料：全价脱脂柞蚕蛹蛋白粉，由吉林省蚕业科学研究院提供；DPPH自由基 ( 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) ，购自美国 Sigma 公司。其他试剂均为分析纯。

仪器：超净工作台，培养箱，高压灭菌锅，pH计，全自动凯氏定氮仪。

1.3 试验方法

1.3.1 单菌种的筛选

取斜面培养基保藏的菌种接种在平板培养基中，在42 ℃下活化培养23 h，然后在平板培养基用接种环挑取1-2环生长旺盛的菌落，接入装有100 mL MRS液体培养基中，42 ℃下，170 r/min摇床培养23 h。以4%接种量接到摇瓶培养基中 ，42 ℃下，170 r/min 摇床培养 23 h。然后，4 800 r/min离心20 min，得到不同菌种的摇瓶发酵液。测定不同菌种发酵液的可溶性多肽含量、SN-TCA指数、DPPH自由基清除率，感官评定值来筛选主发酵菌种。

1.3.2 混合菌种的筛选

选用筛选出来的菌种作为主发酵菌种，将该菌种与两种不同的乳酸菌分别组合进行混合发酵，以不同组合菌种发酵液的可溶性多肽含量、SN-TCA指数、DPPH自由基清除率，感官评定值来筛选最佳组合菌种。

1.3.3 单因素试验

表1-1 单因素试验因素水平表

1.3.4 响应面优化试验

表1-2 响应面优化试验水平表

1.3.5 柞蚕蛹多肽含量的测定[12]

向10 mL不同菌种发酵液中加入10 mL10%三氯乙酸，混匀室温放置30 min后，4 000 r/min离心20 min，利用凯氏定氮法测定上清液中的柞蚕蛹多肽含量。

1.3.6 样品种总氮(蛋白质)的测定

根据国标GB5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》的方法进行试验。

1.3.7 SN-TCA指数的测定[13-14]：

SN-TCA 指数( % ) = ( 样品中可溶性氮量/样品中的总氮量) × 100%

1.3.8 DPPH自由基清除率的测定

以95%乙醇为溶剂，配制 DPPH自由基的浓度为 0. 2mmol /L。取发酵液2 mL，定容到100 mL。混合震荡后在室温下放置30 min，517 nm测定吸光值。

表1-3 DPPH自由基实验加样表

计算公式：DPPH自由基清除率SA(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100%

1.3.9 发酵液感官评定[15-16]

表1-4 发酵液脱臭感官评定值标准

1.4 数据处理

实验数据均为平行测三次的值，采用origin9.0、Design-Expert8.0、Excel软件进行分析。综合利用产业化开发作了探讨。

2 结果与分析

2.1 主发酵菌种的确定

取10名感官评定员的评分值的平均值为最终感官值，结果见表2-1。由表可以看出，嗜热链球菌的发酵液的气味比青春双歧杆菌的气味淡，且副干酪乳杆菌发酵液中稍有臭味，可能是由于菌种生长环境的不稳定性造成的。由图1可知，对不同菌种发酵液进行可溶性多肽、SN-TCA指数和DPPH自由基清除率进行测定。结果表明，嗜热链球菌的多肽含量、SN-TCA指数和DPPH自由基清除率比其他两种菌高。综上考虑，本实验采用嗜热链球菌作为主发酵菌，更能提高蛋白质的水解效果。

表2-1 单菌种发酵液感官评定值

图1 不同菌种可溶性多肽含量、SN-TCA指数和DPPH自由基清除率的比较

2.2 混合菌种组合的确定

表2-2为感官评分设定表。由表2-2可以看出，嗜热链球菌和青春双岐杆菌的发酵液的臭味比嗜热链球菌和副干酪乳杆菌的淡，且嗜热链球菌和副干酪乳杆菌发酵液中略有臭味。由图2可知，菌种组合为嗜热链球菌和青春双岐杆菌的多肽含量、SN-TCA指数和DPPH自由基清除率较高，可以判断菌种组合为嗜热链球菌和青春双岐杆菌混合发酵脱脂柞蚕蛹蛋白得到的发酵产物提取抗氧化肽较好。综上考虑，本实验决定采用嗜热链球菌和青春双歧杆菌这一菌种组合作为最终发酵菌种。

表2-2 混合菌种组合发酵液感官评定值

图2 混合菌种组合可溶性多肽含量、SN-TCA指数和DPPH自由基清除率的比较

2.3 菌种比例的确定

按1.3.1操作，不同菌种比例在接种量4%、pH6.8、42 ℃、170 r/min下摇床发酵23 h，测定发酵液的上清液SN-TCA指数和DPPH自由基清除率。表2-3为感官评分设定表。由表2-3可以看出，菌种比例为1∶3(青春双歧杆菌∶嗜热链球菌)时，发酵液的感官评定值最高且味道无异味。由图3可知，菌种接种比例为1∶3(青春双歧杆菌∶嗜热链球菌)DPPH自由基清除率和SN-TCA指数最大。综合考虑选择菌种比例为1∶3(青春双歧杆菌∶嗜热链球菌)。

表2-3 不同菌种比例发酵液感官评定值

图3 不同菌种比例SN-TCA指数和DPPH自由基清除率的比较

2.4 接种量的确定

按1.3.1操作，不同接种量在菌种比例为1∶3(青春双歧杆菌∶嗜热链球菌)、pH6.8、42 ℃、170 r/min下摇床发酵23 h，测定发酵液的上清液SN-TCA指数和DPPH自由基清除率。表2-4为感官评分设定表。由表2-4可以看出，接种量为4%时，发酵液的感官评定值最高且无异味。由图4可知，当菌种接种量在1%～3%之间变化时，DPPH自由基清除率、SN-TCA指数没有显著的差异，而当接种量为5%时，DPPH自由基清除率较低，可能是菌种将一部分的多肽进行利用，导致抗氧化能力降低。当接种量为4%时，DPPH自由基清除率、SN-TCA指数对比其他接种量较高，说明此接种量适合菌种生长同时发挥功能性作用。综合考虑选择最适菌种接种量为4%。

表2-4 不同接种量发酵液感官评定值

图4 不同接种量SN-TCA指数和DPPH自由基清除率的比较

2.5 发酵温度的确定

按1.3.1操作，不同发酵温度在菌种比例为1∶3(青春双歧杆菌∶嗜热链球菌)、接种量4%、pH6.8、170 r/min下摇床发酵23 h，测定发酵液的上清液SN-TCA指数和DPPH自由基清除率。表2-5为感官评分设定表.由表2-5可以看出，当发酵温度为42 ℃时，发酵液的感官评定值最高为4.45且无异味。如图5可知，随着发酵温度的升高，各温度下的发酵液的上清液SN-TCA指数和DPPH自由基清除率无显著性差异。当发酵温度为42 ℃时，DPPH自由基清除率达最大。综合考虑选择最适发酵温度为42 ℃。

表2-5 不同发酵温度发酵液感官评定值

图5 不同发酵温度SN-TCA指数和DPPH自由基清除率的比较

2.6 发酵时间的确定

按1.3.1操作，不同发酵时间在菌种比例为1∶3(青春双歧杆菌∶嗜热链球菌)、接种量4%、pH6.8、42 ℃、170 r/min下摇床发酵一定时间，测定发酵液的上清液SN-TCA指数和DPPH自由基清除率。表2-6为感官评分设定表.由表2-6可以看出，当发酵时间为22 h时，发酵液的感官评定值最高为4.13且无异味。由图6可知，随着发酵时间的延长，DPPH自由基清除率、水解度都随之增大，当发酵时间达到22 h时，DPPH自由基清除率达最大。综合考虑选择最适发酵时间为22 h。

表2-6 不同发酵时间发酵液感官评定值

图6 不同发酵时间SN-TCA指数和DPPH自由基清除率的比较

2.7 pH的确定

按1.3.1操作，菌种比例为1∶3(青春双歧杆菌∶嗜热链球菌)、接种量4%、42 ℃、170 r/min下摇床发酵23 h，测定发酵液的上清液SN-TCA指数和DPPH自由基清除率。表2-7为感官评分设定表。由表2-7可以看出，当pH为6.8 时，发酵液的感官评定值最高为4.74且无异味。由图7可知，当pH在6.4～6.6、7.0～7.2之间变化时，DPPH自由基清除率变化不大，SN-TCA指数呈先升高后降低变化趋势，当pH为6.8时，DPPH自由基清除率最好，可能在此条件下，菌种生长较好，菌种与产物结合能力较高，酶活力较高，SN-TCA指数也较高，使产物的抗氧化能力增加。综合考虑选择最适pH值为6.8。

表2-7 不同pH发酵液感官评定值

图7 不同pH SN-TCA指数和DPPH自由基清除率的比较

2.8 响应面优化试验

根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，以pH、菌种接种量、发酵温度、发酵时间为自变量，以感官评定值为除臭指标，以DPPH自由基清除率为提取抗氧化肽指标，设计四因素三水平响应曲面实验。

2.8.1 以感官评定值为指标的响应面实验

由表2-8可以看出，感官评定值整体模型的P值<0.0001，说明模型极显著，失拟项的P值分别是0.0579>0.05，说明实验方法是可靠的，使用这个模型模拟真实的四因素三水平的分析是可行的。相关系数R2为0.9683，表明感官评定值的预测值与实际值之间具 有 较 好 的 拟 合 度。其 校 正 决 定 系 数 R2Adj为0.9365，表明只有约6.35%的总变异不能用此模型来解释，模型的信噪比为17.863>4，进一步说明本模型设计是非常成功的。从三个因素对水解效果的影响来看，回归方程的一次项A(P<0.0001)和B(P<0.0001)对感官评定值的线性效应有极显著影响，影响评定值顺序为pH>菌种接种量>发酵时间>发酵温度；二次项A2、B2、C2、D2均<0.001，说明对感官评定值的曲面效应均有极显著影响。AD<0.05，说明交互作用显著，而其他因素交互作用的P值均大于0.5，说明其交互作用均对感官评定值的影响不显著。其交互作用的响应曲面见图8。

表2-8 感官评定值回归模型方差分析

图8 各因素对感官评定值的影响

通过Design Expert 8.0软件回归分析，得到与各因素之间的二次多项回归方程为：

Y=4.55-0.043A-0.084B+0.026C+0.031D+0.000AB+0.023AC+0.050AD+5.000×10-3BC+2.500×10-3BD+0.010CD-0.088A2-0.11B2-0.12C2-0.070D2

2.8.2 以DPPH自由基清除率为指标的响应面实验

由表2-9可以看出，DPPH自由基清除率整体模型的P值<0.0001，说明模型极显著，失拟项的P值分别是0.0807>0.05，说明实验方法是可靠的，使用这个模型模拟真实的四因素三水平的分析是可行的。相关系数R2为0.9472，表明感官评定值的预测值与实际值之间具 有 较 好 的 拟 合 度。其 校 正 决 定 系 数 R2Adj为0.8945，表明只有约10.55%的总变异不能用此模型来解释，模型的信噪比为15.727>4，进一步说明本模型设计是非常成功的。从三个因素对水解效果的影响来看，回归方程的一次项A(P<0.05)对DPPH自由基清除率的线性效应有显著影响，影响评定值顺序为pH>发酵时间>发酵温度>接种量；二次项A2、C2、D2均<0.001说明对DPPH自由基清除率的曲面效应均有极显著影响。AC、BC和CD<0.05，说明交互作用显著，而其他因素交互作用的P值均大于0.5，说明其交互作用均对感官评定值的影响不显著。其交互作用的响应曲面见图9。

表2-9 DPPH·清除率回归模型方差分析

图9 各因素对DPPH自由基清除率的影响

通过Design Expert 8.0软件回归分析，得到与各因素之间的二次多项回归方程为：

Y=93.48-0.073A-0.078B+0.024C+0.033D+0.095AB+1.25AC+0.043AD-0.77BC+0.040BD+1.32CD-2.34A2-1.04B2-3.34C2-1.87D2

2.8.3 验证实验

由 Design Expert 8.0分析实验结果，得出感官评定值响应曲面的最优方案为: pH为6.76，接种量为3.61%，发酵温度为42.72 ℃，发酵时间为23.31 h，在此条件下感官评分理论上可达到4.57174；以DPPH自由基清除率响应面的最优方案为：pH为6.77，接种量为4.02%，发酵温度为42.56 ℃，发酵时间为23.19 h，在此条件下DPPH自由基清除率理论上可达到93.5498%。在此条件下进行实验得出: SN-TCA 指数为 48.38%，DPPH自由基清除率79.82%。由于实验操作的可行性，将微生物发酵法脱除柞蚕蛹蛋白臭味和制备抗氧化肽的工艺条件修正为pH为6.8，接种量为4%，发酵温度为43 ℃，发酵时间为23 h，在此条件进行3次平行验证实验，感官评定均值为4.65，DPPH自由基清除率为93.78%，证实该模型的有效性。

3 结 论

1)采用3种乳酸菌发酵脱脂柞蚕蛹蛋白，通过测定感官评定值、可溶性多肽含量、SN-TCA指数，以及发酵产物的DPPH自由基清除率选择嗜热链球菌(1.1855)作为发酵制备脱脂柞蚕蛹蛋白抗氧化肽的主发酵菌种。

2)选用筛选出来的嗜热链球菌(1.1855)作为主发酵菌种，将该菌种与两种不同的乳酸菌分别组合进行混合发酵，以不同组合菌种发酵液的可溶性多肽含量、SN-TCA指数、DPPH自由基清除率，感官评定指标值确定最佳混合菌种组合为青春双歧杆菌和嗜热链球菌，菌种比例为1∶3。

3)通过响应面分析优化微生物发酵法脱除柞蚕蛹蛋白臭味和制备抗氧化肽的工艺条件，得到最佳工艺条件为：pH为6.8，接种量为4%，发酵温度为43 ℃，发酵时间为23 h。在最佳条件下进行发酵试验，测得感官评定值为4.65，DPPH自由基清除率为93.78%。