蛹虫草菌保藏方法对其生产能力的影响

刘 娟 张俊辉 王 芹 周 影 钱 锟 祝长杰

(吉林省蚕业科学研究院，吉林吉林 132012)

柞蚕蛹虫草中含有丰富的蛋白质及氨基酸，蛋白质含量为30%，氨基酸含量为22%，还含有冬虫夏草所不含有的抗癌物质虫草素，所以蛹虫草是冬虫夏草的良好替代品。在柞蚕蛹虫草的批量生产中，蛹虫草菌的保藏方法对柞蚕蛹虫草的产量及活性物质含量影响较大。本文对蛹虫草菌的保藏方法及不同保藏方法对蛹虫草菌生产能力的影响作一探讨。

1 材料与方法

1.1 供试材料

蛹虫草菌，柞蚕蛹，均由吉林省蚕业科学研究院提供。PDA培养基：马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(potato dextrose agar medium，PDA)；丰富培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，磷酸钠0.25%，磷酸氢二钾0.15%，硫酸镁0.075%，马铃薯15%；米饭培养基：大米20%，大麦35%，糙米20%，黄豆25%。

1.2 试剂与仪器

试剂：乙腈、甲醇购于美国Fisher试剂公司，虫草素标准品购于国药集团。仪器：Agilent 1290超高效液相色谱仪，KOKUSAN H-19F离心机，0.45μm水系滤膜等。

1.3 试验方法

1.3.1 蛹虫草菌冷冻保藏

蛹虫草菌接种于米饭培养基中，接种量为15%，待蛹虫草菌长满米饭培养基后继续培养10 d，放置于-19 ℃冷冻保藏。

1.3.2 冷冻保藏蛹虫草菌活化

取-19 ℃冷冻保藏的蛹虫草菌，放置于-4 ℃的环境中进行活化12 h再应用于试验中。

1.3.3 柞蚕蛹虫草培育

取固体培养基上生长旺盛、转色能力强的蛹虫草菌菌块(约黄豆粒大小)接种于100 mL PDA液体培养基中，23 ℃避光、120 r/min摇床培养96 h，得到蛹虫草菌菌丝球悬液。每只柞蚕蛹接种量为0.2～0.3 mL。在适当培养条件下进行柞蚕蛹虫草的培育(吉林省蚕业科学研究院专利技术)，测定蛹虫草菌的僵化率和出草率，得到柞蚕蛹虫草。

1.3.4 蛹虫草菌继代培育

取PDA固体培养基上生长旺盛、转色能力强的第1代蛹虫草菌约黄豆粒大小，再次接种于PDA固体培养基中，23 ℃避光培养至蛹虫草菌全部覆盖培养基后见光培养，此为第2代菌株，依次继代培养至第6代菌株，即得到蛹虫草菌的第1代至第6代菌株。丰富培养基继代培育相同。

1.3.5 样品的制备

柞蚕蛹虫草60 ℃烘干至恒重，粉碎，100目过筛，取0.5 g柞蚕蛹虫草粉加水定容至100 mL，超声水提3 h，5 000 r/min离心取上清，0.45 μm水系滤膜过滤用于液相色谱测定。

1.3.6 虫草素含量测定

精密称取虫草素标准品，配制成浓度范围为0.255～50 μg/mL的标准品溶液，每浓度进样10 μL，3次平行。HPLC检测条件：Welch Ultimate XB-C18色谱柱(5 μm，4.6mm×250mm)；流动相为水：乙腈=90∶10(V/V)；柱温30 ℃；流速1 mL/min；进样量10 μL；检测波长260 nm。

记录不同浓度虫草素标准品溶液吸收峰面积并取平均值，以虫草素标准品浓度为横坐标，以其不同浓度所对应的吸收峰面积为纵坐标。绘制虫草素标准曲线。图1为虫草素标准溶液(20 ug/mL)液相色谱图，图2为虫草素标准曲线，线性方程为Y=0.6693X+0.5083，R2=0.9999。

图1 虫草素标准溶液(20 ug/mL)液相色谱图

图2 虫草素标准曲线

2 结果与分析

2.1 蛹虫草菌冷冻保藏不同时间对其生产能力的影响

蛹虫草菌在冷冻保藏不同时间时注蛹后其柞蚕蛹虫草的数量见图3，随着冷冻保藏时间的延长，蛹虫草菌均出现出草率降低的情况。以菌株B为例，初始时菌株B出草率为82.3%，冷冻保藏6月激活后出草率为80.7%，较初始时出草率降低1.9%；冷冻保藏12月激活后出草率为74.3%，较初始时出草率降低9.7%；冷冻保藏18月激活后出草率为69.7%，较初始时出草率降低15.3%。可见，随着冷冻保藏时间的延长蛹虫草菌仍然具有生产能力，但生产能力大幅下降，故以生产柞蚕蛹虫草为目的批量生产中，蛹虫草菌不适合过长时间冷冻保藏。

图3 蛹虫草菌冷冻保藏不同时间对其生产能力的影响

2.2 蛹虫草菌冷藏保藏不同时间对其生产能力的影响

不同蛹虫草菌在冷藏保藏不同时间时注蛹后柞蚕蛹虫草的数量见图4，随着冷藏保藏时间的延长，不同蛹虫草菌均出现出草率降低的情况。以菌株B为例，初始时菌株B出草率为82.3%；冷藏保藏6月后出草率为78.3%，较初始时出草率降低4.9%；冷藏保藏12月后出草率为70.3%，较初始时出草率降低14.6%；冷藏保藏18月后出草率为64%，较初始时出草率降低22.2%。可见，随着冷藏保藏时间的延长蛹虫草菌注蛹后出草率逐渐降低，故以生产柞蚕蛹虫草为目的批量生产中，蛹虫草菌亦不适合过长时间冷藏保藏。

图4 蛹虫草菌冷藏保藏不同时间对其生产能力的影响

2.3 蛹虫草菌冷藏保藏不同时间其虫草素含量变化

蛹虫草菌在冷藏保藏不同时间注蛹后柞蚕蛹虫草中虫草素含量见图5，随着蛹虫草菌冷藏保藏时间的延长，柞蚕蛹虫草出现虫草素含量降低的现象。以菌株D为例，初始时虫草素含量为1.07 mg/g，冷藏保藏6月后虫草素含量为1.01 mg/g，较初始时含量降低5.6%；冷藏保藏12月后虫草素含量为0.93 mg/g，较初始时含量降低13.1%；冷藏保藏18月后虫草素含量为0.87 mg/g，较初始时含量降低18.7%。可见，随着蛹虫草菌冷藏保藏时间的延长柞蚕蛹虫草中虫草素含量逐渐降低。

图5 蛹虫草菌冷藏保藏不同时间其虫草素含量变化

2.4 蛹虫草菌在丰富培养基中不同传代次数时其生产能力的变化

蛹虫草菌在丰富培养基中不同传代次数时生产能力见图6。以菌株A为例，第1代蛹虫草菌出草率为86.7%；第2代蛹虫草菌出草率为81%，较第1代下降6.6%；第3代出草率为76.7%，较第1代下降11.5%；第4代蛹虫草菌出草率为72.3%，较第1代下降16.6%；第5代蛹虫草菌出草率为68.7%，较第1代下降20.8%；第6代出草率为63.7%，较第1代下降26.5%。可见，丰富培养基中蛹虫草菌随传代次数的增加其生产能力均出现下降的现象，故在柞蚕蛹虫草的批量生产中蛹虫草菌不适宜在丰富培养基中传代次数过多。

图6 蛹虫草菌在丰富培养基中不同传代次数时其生产能力的变化

2.5 蛹虫草菌在PDA培养基中不同传代次数时其生产能力的变化

在PDA培养基中，蛹虫草菌在不同传代次数时出草率见图7，蛹虫草菌在PDA培养基中继代培育其出草率均不断降低。以菌株A为例，第1代蛹虫草菌出草率为86%；第2代蛹虫草菌出草率为83.7%，较第1代下降2.7%；第3代出草率为78.7%，较第1代下降8.5%；第4代蛹虫草菌出草率为73.3%，较第1代下降14.8%；第5代蛹虫草菌出草率为68.7%，较第1代下降20.1%；第6代出草率为65%，较第1代下降24.4%。可见，在PDA培养基中蛹虫草菌随传代次数的增加其生产能力均出现下降的现象，且趋势与在丰富培养基中相同。

图7 蛹虫草菌在PDA培养基中不同传代次数时其生产能力的变化

3 讨 论

在柞蚕蛹虫草的生产中，蛹虫草菌的保藏时间、保藏方法、传代次数等都对柞蚕蛹虫草生产的影响巨大。

菌种保藏过程中，随着保藏时间的延长蛹虫草菌均会出现生产能力降低的现象，但冷冻保藏较冷藏保藏蛹虫草菌生产能力降低的速度慢，故冷冻更适合用来保藏蛹虫草菌，但在柞蚕蛹虫草的批量生产中还应尽量减少蛹虫草菌的保藏时间以达到良好的生产效果。

随着冷藏保藏时间的延长虫草素含量逐渐降低，故在以高产虫草素为目的的柞蚕蛹虫草的批量生产中，应尽量减少蛹虫草菌的保藏时间。

PDA培养基中虫草菌生产能力下降的速度在不同传代次数时均慢于在丰富培养基中，可见PDA培养基更适合蛹虫草菌的继代保藏，在柞蚕蛹虫草的批量生产中应尽量选择PDA培养基作为蛹虫草菌的保藏培养基，同时尽量减少生产用蛹虫草菌的传代次数，以达到高产柞蚕蛹虫草的目的。