绢纺精练液中丝胶蛋白的氨基酸组成、相对分子量及溶解性的测定

王志强 张慧华

(1.南阳市经济作物技术推广站，河南南阳 473000；2.河南民兴生物科技股份有限公司，河南社旗 473300)

用蚕丝生产丝织品的过程中需要经过精练工序，以除去残余的丝胶[1]和杂质。丝胶蛋白具有保水吸湿[2]、抗氧化[3]、凝胶化[4]、防治糖尿病[5]、皮肤消炎和消毒[6]等多种生物活性，已广泛应用在织物后整理涂层、化妆品添加剂等领域[7-8]，是一种理想的医药和功能性生物材料[9]。从绢纺精练液中提取高纯度、易溶性丝胶粉末,将丝胶废液变废为宝,对保护环境和增加生产效益具有重要意义。桑蚕丝条吐是绢纺材料之一，本文对桑蚕丝条吐精练液中回收的丝胶蛋白的氨基酸组成、相对分子质量及溶解性进行测定，以期为丝胶蛋白的进一步研究和应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丝胶蛋白粉，桑蚕丝条吐精练液中提取所得，蛋白质含量91.26%(河南民兴生物科技股份有限公司中式设备生产，具体工艺参照王志强等[10]的方法)；碳酸钠、柠檬酸三钠、丙烯酰胺、N，N'-亚甲基双丙烯酰胺、氨水、丙酮(国药试剂)；盐酸、三羟甲基氨基甲烷、4×蛋白上样缓冲液(含β-巯基乙醇)、四甲基乙二胺、过硫酸铵、氯化钠、甲醇、冰醋酸、彩虹广谱蛋白Marker(范围11～180 KD、3.3～20.1 KD)、十二烷基硫酸钠、甘氨酸、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝 G-250(北京索莱宝有限公司)；木瓜蛋白酶、大豆分离蛋白(美国 Sigma 公司)。

恒温水浴锅 HH-2(浙江力辰仪器科技有限公司)；pH计 PHS-3E(上海仪电科学仪器股份有限公司)；紫外可见分光光度计752N (上海精密科学仪器有限公司)；电泳仪 DYY-300(美国Bio-Rad)；全自动氨基酸分析仪(德国Mem Barpure GmbH公司)；超纯水机、鼓风干燥箱(浙江力辰仪器科技有限公司)；电子天平(上海恒平)；磁力搅拌器(金坛大地公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 丝胶蛋白氨基酸的组成

1)样品处理：称取25 g丝胶蛋白，去除脂肪、碳水化合物、色素和无机盐。置于85 ℃烘箱烘干备用。酸水解：称取干燥的丝胶蛋白7.5 mg，加入 2 mL5.7 mol/L盐酸，置于110 ℃烘箱内水解 24 h，然后除去过量的盐酸，加入48 mL柠檬酸缓冲液稀释到50 mL，摇匀，使蛋白质完全变成氨基酸。取0.15 μmol的水解丝胶蛋白，分为20组上柱进行分析。

2)分析：经过上述处理后的丝胶蛋白上柱进行分析。取水解丝胶蛋白 0.15μmol(水解丝胶蛋白干重为 0.45 mg)。在 pH5、100 ℃下进行测定，反应时间 12 min，生成的紫色物质在 570 nm 波长下进行比色测定，生成的黄色化合物在 440 nm 波长下进行比色测定。同时将20组丝胶蛋白样品一起装入仪器，自动按序分析，最后自动计算出精确数值。重复测定3～5次，并以“平均值±标准差”(SD)的形式表示。

1.2.2 丝胶蛋白分子量的测定

采用SDS-PAGE法测定丝胶蛋白的相对分子质量。本实验采用15%的分离胶和4%的浓缩胶及1.5M pH8.8的Tris-盐酸和1M pH6.8的Tris-盐酸的缓冲液。制备凝胶，上样(每孔上样量10 μL，共10孔)，在80 V电压下电泳30 min，120 V下电泳1 h，取出凝胶，固定(甲醇∶冰醋酸=4∶1 100),用考马斯亮蓝 G-250溶液染色4 h以上，染色结束后脱色(甲醇∶冰醋酸=5∶1 100)3～5次，每次间隔30～60 min，直到蛋白质条带清晰可见，与蛋白标准品条带比对确定丝胶蛋白的相对分子质量。

1.2.3 丝胶蛋白的溶解性的测定

以丝胶蛋白溶液中牛血清白蛋白(BSA)当量来表征其溶解性，BSA当量越高，丝胶蛋白的溶解性越好。配置不同温度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)和不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)的浓度为1.0%(w/V)的丝胶蛋白溶液，以探究温度、pH值对丝胶蛋白的溶解性的影响。取5.00 mL 丝胶蛋白样品10 000 g离心10 min，取500 μL稀释20倍的上清液于试管中，加入 5.00 mL 考马斯亮蓝 G-250溶液，混匀后室温静置 3 min，测定其在595 nm处的吸光值，并根据标准曲线计算出BSA当量。

标准曲线的绘制：用0.04～0.20 mg/mL(5个浓度)的BSA代替丝胶蛋白样品，其他操作同上，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线(标曲方程：y= 2.6286x +0.0135 , R2=0.997)。

2 结果与分析

2.1 丝胶蛋白的氨基酸组成

丝胶蛋白氨基酸组成见表1。从表1可以看出，丝胶蛋白含有18种氨基酸，极性氨基酸占80.39%，非极性氨基酸占19.61%，其中丝氨酸含量最高，占氨基酸总量的27.52%，其次是天冬氨酸、苏氨酸及甘氨酸，分别占15.91%、7.41%和7.29%。

表1 丝胶蛋白的氨基酸组成

2.2 丝胶蛋白相对分子质量的测定

丝胶蛋白电泳图谱见图1。

图1 丝胶蛋白电泳图

采用15%的分离胶和4%的浓缩胶及1.5 M pH8.8的Tris-盐酸和1 M pH6.8的Tris-盐酸的缓冲液电泳体系，来测定丝胶蛋白得相对分子质量(图1)。从图1可以看出，桑蚕丝条吐精炼液中的丝胶蛋白相对分子质量大致分布在17～118 KD(条带1、2、3)，集中分布于17～75 KD，通过膜过滤提取的丝胶蛋白分子量大致分布在17～75 KD(条带4、5、6)，且随脱胶条件的改变而有所不同。

2.3 丝胶蛋白溶解性的测定

不同温度及pH值下丝胶蛋白的溶解性测定结果见图2。

图2 不同温度及pH值下丝胶蛋白的溶解性

图2A为不同温度对丝胶蛋白溶解性的影响。从图中可看出，在温度从30 ℃升高至60 ℃时，丝胶蛋白的溶解性由0.14 mg/mL逐渐升高至0.18 mg/mL，SPI的溶解性由0.11 mg/mL升高至0.16 mg/mL，两种蛋白的溶解性均随着温度的升高而增强，但在相同温度下，丝胶蛋白的溶解性强于大豆分离蛋白。

图2B为不同pH值下丝胶蛋白的溶解性。从图中可看出，在pH值为3.0时，丝胶蛋白溶液中的可溶性蛋白含量最低为0.15 mg/mL，此时溶解性最差，这是由于丝胶蛋白等电点在pH 值3.5左右，此时丝胶蛋白的变性程度较大，溶解性最差；之后随着pH值的升高，丝胶蛋白溶液的溶解性逐渐增强，这是由于当pH值高于等电点后，随着pH值的升高，丝胶蛋白所带负电荷增多，溶解性增强。此外，在相同的pH值下，丝胶蛋白的溶解性强于大豆分离蛋白。

3 结 论

本文对从废水中回收的丝胶蛋白的氨基酸组成、相对分子质量及溶解性进行测定，以期为丝胶蛋白的进一步应用提供参考。通过实验发现丝胶蛋白质的氨基酸含量十分丰富，丝胶蛋白含有18种氨基酸，极性氨基酸占80.39%，非极性氨基酸占19.61%，其中丝氨酸含量最高，占氨基酸总量的27.52%，其次是天冬氨酸、苏氨酸及甘氨酸，分别占15.91%、7.41%和7.29%。蚕丝桑条吐精炼液中的丝胶蛋白分子量分布在17～135 KD之间，集中分布于17～75 KD之间，且随脱胶条件的改变而有所不同。丝胶蛋白具有良好的溶解性，其溶解性优于水解胶原蛋白。