HER-2染色在两种不同免疫组化染色平台结果不一致的分析

申敬伟 董芳莉 杨海军

安阳市肿瘤医院病理中心，河南 455000

人表皮生长因子受体-2（HER-2）是定位于染色体17q12-21，32 上的原癌基因-人表皮生长因子受体2 基因（C-erbB-2 基因）编码的相对分子质量为185 000 的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性。该蛋白结构分为3 个部分：胞外区域（ECD）、跨膜区域与胞內酪氨酸激酶区域。正确检测和评定乳腺癌和胃癌的HER-2 蛋白表达和基因扩增状态对乳腺癌和胃癌的临床治疗及预后判读至关重要［1-3］。目前对HER-2表达评估的金标准是组织学方法，即通过免疫组化（IHC）或荧光原位杂交（FISH）技术对患者的组织标本进行检测，免疫组化作为评价HER-2 蛋白状态简便且实用的方法被广泛应用。近年全自动免疫组化染色平台的应用在免疫组化染色的标准化控制中起重要作用［4］，但不同免疫组化染色平台染色效果存在一定的差异。本实验将HER-2 抗体在两种不同免疫组化染色平台结果不一致的原因分析报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2019 年1—9 月本院病理科存档的肿瘤标本40例，其中浸润型乳腺癌25例，胃腺癌15例。

1.2 仪器与试剂 美国Roche Ventana XT 全自动免疫组化仪；德国Leica Bond Max 全自动免疫组化仪；Leica RM2235型石蜡切片机；德国Leica 显微镜；HER-2抗体（4B5，工作液）为美国Roche公司产品；Roche封闭式二抗系统；Leica封闭式二抗系统。

1.3 方法 蜡块连续3 μm切片2张，分别用贴置Roche、Leica标签的防脱载玻片捞片，添加阳性对照组织，70 ℃烤片50 min，罗氏标签的玻片牛奶浸泡15 min，分别上机全自动处理。Roche Ventana和Leica Bond全自动免疫组化染色平台均使用Roche公司的HER-2抗体（4B5，工作液），同一批号，分别使用各自封闭的二抗系统。两种染色平台使用各自的标准化SOP操作流程。染色结果在显微镜下观察对比。

1.4 判读标准 （1）乳腺癌HER-2免疫组化判读参照我国乳腺癌HER-2 检测指南（2019 版）［2］，0：阴性，无染色或≤10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；1+：阴性，＞10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；2+：不确定，＞10%的浸润癌细胞呈现弱到中等强度的、完整细胞膜染色或≤10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色；3+：阳性，＞10%的浸润癌细胞呈现强、完整、均匀的细胞膜染色。（2）胃癌HER-2 免疫组化判读参照我国胃癌HER-2 检测指南（2011 版）［5］，0：阴性，无反应或＜10%肿瘤细胞膜染色；1+：阴性，≥10%肿瘤细胞微弱或隐约可见细胞膜染色；仅有部分细胞膜染色；2+：不确定，≥10%肿瘤细胞有弱到中度的基底侧膜、侧膜或完全性细胞膜染色；3+：阳性，≥10%肿瘤细胞基底侧膜、侧膜或完全性细胞膜强染色。

2 结 果

2.1 浸润性乳腺癌HER-2 在两种全自动免疫组化仪的染色结果 25 例浸润性乳腺癌HER-2 在Roche Ventana XT 和Leica Bond Max 全自动免疫组化的染色结果比较差异有统计学意义（P＜0.05），Kappa 值0.135，一致性较差，具体见表1及图1～2。

表1 25例浸润性乳腺癌HER-2在两种全自动免疫组化仪的染色结果（n）

2.2 胃癌HER-2 在两种全自动免疫组化仪的染色结果 15例胃癌HER-2在Roche Ventana XT和Leica Bond Max全自动免疫组化仪的染色结果比较差异无统计学意义（P＞0.05），Kappa值0.186，一致性较差，具体见表2及图3～4。

表2 15例胃癌HER-2在两种全自动免疫组化仪的染色结果（n）

3 讨 论

正确检测和评定乳腺癌和胃癌的HER-2 蛋白表达和基因扩增状态对乳腺癌和胃癌的临床治疗及预后判断至关重要［3，6］，因此，HER-2 检测结果的准确性和可重复性非常重要。全自动免疫组化染色平台在免疫组化技术中应用广泛，染色结果可靠，操作简单，背景清晰，染色效果更佳［7］。本实验室一直使用Roche Ventana XT 染色平台进行HER-2（4B5）检测，染色效果满意。HER-2（4B5）抗体含有足够50 次试验的试剂，50 次用完后试剂瓶里还存有1 ml左右的试剂量，残存的试剂在Leica Bond Max 染色平台进行HER-2（4B5）检测，未达到理想效果。本实验室发现HER-2（4B5）在Roche Ventana XT 染色平台效果优于 Leica Bond Max，25 例浸润性乳腺癌 HER-2 在 Roche Ventana XT和Leica Bond Max 全自动免疫组化仪的染色结果比较差异有统计学意义（P＜0.05），Kappa值0.135，一致性较差；15例胃癌 HER-2 在 Roche Ventana XT 和 Leica Bond Max 全自动免疫组化仪的染色结果比较差异无统计学意义（P＞0.05），但是Kappa 值0.186，一致性较差。可能原因是样本例数较少，有待后续实验增加样本例数进行验证。

HER-2（4B5）抗体是一种兔单克隆抗体，与石蜡包埋的组织切片中的HER-2 相结合。使用可识别兔免疫球蛋白的生物素结合二抗，使用二抗HRP 结合物对特异性抗体进行定位。随后通过酶反应底物的沉淀使特异性抗体-酶复合物显色。Roche 封闭式二抗系统即Ultra View Universal DAB Detection Kit 含有HRP 标记的抗体混合物（山羊抗小鼠IgG，山羊抗小鼠IgM 和山羊抗兔）。Leica 封闭式二抗系统即Bond Polymer Refine Detection 含有抗兔多聚物HRP-IgG。 HER-2（4B5）工 作 液 和 Roche 二 抗 系 统 是Ventana XT 的封闭式一抗和二抗，两者匹配运用于Roche Ventana XT 染色平台，效果最优。HER-2（4B5）工作液用于Leica Bond Max 染色平台属于开放型一抗，需要用Bond 一抗稀释液稀释到合适的浓度，才能结合Bond Polymer Refine Detection 达到最优化的使用条件。本实验直接使用HER-2（4B5）工作液用于Leica Bond Max 染色平台，出现3+阳性例数增多和染色过深，可能和一抗的浓度有关。

决定免疫组化染色效果的重要因素是抗原修复，肿瘤标本经10%中性福尔马林固定和石蜡包埋后，大量蛋白相互交联，抗原修复打开交联的蛋白，暴露抗原［8］。合适的修复液是影响抗原修复效果的重要因素，Roche Ventana XT 抗原修复液pH 8.0～8.5，Leica Bond Max 抗原修复液pH 9.0。本实验HER-2（4B5）工作液用于Leica Bond Max 染色平台2+和3+结果多于Roche Ventana XT 染色平台，其中2 例染色比阳性对照组织染色深，非特异背景增加，可能与高pH值抗原修复液有关。在实际工作中，抗原有最合适的pH 值范围。因为组织经固定、包埋后抗原表面所带电荷发生改变，从而影响抗原与抗体的结合，在一定pH 值修复液中进行修复，会恢复抗原表面原来的带电荷状态，达到最佳染色效果［9］。

图1 Roche Ventana XT 染色平台浸润型乳腺癌2+（HER-2 ×20） 图2 Leica Bond Max 染色平台浸润型乳腺癌3+（HER-2 ×20） 图3 Roche Ventana XT 染色平台胃癌2+（HER-2 ×20） 图4 Leica Bond Max 染色平台胃癌3+（HER-2 ×20）

决定免疫组化染色效果的另一重要因素是一抗的染色，两种免疫组化染色平台的技术原理不同，Roche Ventana XT 采用液体封盖膜技术，防止试剂挥发，同时采用空气涡流技术混匀试剂，一抗受到稀释，达到最佳浓度。Leica Bond Max 采用Covertiles 技术，试剂侧面微量泵抽吸，直接滴加在组织表面，抗原抗体结合，对于开放性一抗，如果没有稀释，浓度偏高，影响染色结果。

综上所述，不同的免疫组化染色平台的技术原理及配套的封闭试剂不同，其染色效果液存在一定差异。因此，为了提高病理切片质量，推进规范化操作流程，针对不同的抗体选用合适的染色平台。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。