环孢素治疗儿童肾病综合征的临床效果观察

曲英慧 周海澜

聊城市第三人民医院儿科，山东 252000

原发性肾病综合征（primary nephrotic syndrome，PNS）属于临床常见的儿科疾病，占到所有肾病综合征90%以上，患儿出现大量的蛋白尿、水肿和低蛋白血症等体征，严重地影响了患儿生活质量与身心健康，研究发现该病的发生同免疫因素、环境和遗传等因素均关系密切［1］。目前临床治疗PNS主要以激素治疗为主，但是单一使用效果不好，而且不良反应较重，免疫抑制药物治疗也是重要手段，可以缓解蛋白尿体征，但是均由于存在严重的不良反应导致长期使用受到限制，环孢素A（cyclosporine A，CsA）为钙调磷酸酶抑制剂类药物，在改善肾脏疾病预后中具有重要意义，而且临床联合激素治疗PNS报道较为少见［2］。Toll样受体属于人体重要跨膜蛋白，是天然免疫受体，可以对病原微生物分子模式识别，在免疫机能方面具有重要作用，同时能够对获得性免疫提供刺激信号，引导形成一系列免疫反应，但是在肾病综合征患儿中以往报道少见［3］。本研究分析了CsA 治疗PNS 患儿的疗效及对Toll 样受体（TLRs）表达的影响，以期为临床提供指导和依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2016年1月至2018年12月肾病内科收治的100例PNS患儿，采用随机数字表法分为研究组（泼尼松＋CsA）和对照组（泼尼松＋霉酚酸酯）各50例。（1）纳入标准：①PNS患儿的诊断标准参考中华医学会儿科学分会肾病学组制定的相关标准；②PNS患儿主要表现为大量蛋白尿：一周内3次尿蛋白定性达到或超过（+++）（++++），或者24 h尿蛋白定量达到或超过50.0 mg/kg；③低蛋白血症（患儿血浆白蛋白＜25.0 g/L）；④治疗前均行肾脏穿刺检查确诊；⑤患儿年龄范围为3～14 岁；⑥治疗前与患儿家属签署知情同意书。（2）排除标准：①肾脏肿瘤、结核；②先天性心脏病；③遗传或染色体畸变；④患儿血肌酐（Cr）＞3.0 mg/dl；⑤患儿伴有严重的感染、肝功能障碍、血液系统疾病等；⑥对治疗药物具有严重的过敏反应；⑦狼疮性肾炎、IgA肾病、紫癜性肾病等其他原因引起的肾脏疾病。研究组患儿中男32 例，女18 例；年龄范围为2～14 岁，年龄（6.5±2.3）岁；病程范围为3～36 个月，病程（14.2±7.9）个月；肾脏穿刺病理学：微小病变型26例、系膜增生性肾小球肾炎8例、局灶节段性肾小球硬化10例、膜增生性肾小球肾炎6例；治疗前患儿尿蛋白排泄量为（93.2±33.1）mg（/kg·d）；中途有2 例患儿转院治疗。对照组患儿中男29 例，女21 例；年龄范围为2～14 岁，年龄（6.4±3.0）岁；病程范围为3～36 个月，病程（13.8±6.2）个月；肾脏穿刺病理学：微小病变型29 例、系膜增生性肾小球肾炎7 例、局灶节段性肾小球硬化7 例、膜增生性肾小球肾炎7例；治疗前患儿尿蛋白排泄量为（96.0±35.0）mg（/kg·d）；有3例患儿因各种原因转院或退出本研究。两组患儿的年龄、性别等上述基线资料比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经本院医学伦理委员会审批通过。

1.2 方法 （1）对照组：采用泼尼松（华中药业股份有限公司生产，国药准字H42021394，药品批号：20180211）＋霉酚酸酯（上海罗氏制药有限公司生产，国药准字H20052237，药品批号：20180305）治疗，泼尼松口服，初始服用剂量为2 mg（/kg·d），最大剂量应低于60 mg/d，晨起服用，4～8 周后减量 2.5～5.0 mg，直至 0.5～1.0 mg/kg 维持治疗3个月，随后每周减量2.5～5.0 mg直至停药。霉酚酸酯剂量20～30 mg（/kg·d），分为2次口服，连续服用1年。（2）研究组：采用泼尼松＋CsA（辰欣药业股份有限公司生产，国药准字H20113117，药品批号：2018109）治疗，泼尼松治疗方法同对照组，CsA在患者开展激素治疗第4周开始使用，剂量2～3 mg（/kg·d），血药谷浓度维持在80～120 μg/L，连续服用1年。

1.3 实验室指标检测 抽取治疗前后患儿空腹静脉血4ml，在外周血单个核细胞中进行转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）mRNA、白细胞介素 -18（IL-18）mRNA 提取，提取总RNA 后将反应物放置37 ℃水浴箱中孵育60 min，获取反转录产物cDNA，采用RT-PCR 法进行监测，反应为美国应用生物系统公司制造生产的ABI 7500 荧光定量PCR 仪器操作，试剂盒由天根生化科（北京）有限公司生产。经抽取空腹静脉血脱酶后置于无菌玻璃离心管，使用RNAiso Plus RNA 提取试剂盒提取单个核细胞总RNA，提取总RNA 后将反应物放置37 ℃水浴箱中孵育60 min，获取反转录产物cDNA，样本放至热循环仪中，反应条件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s 4 ℃循环 1 次。反应完成后，再次将样本放至冰中冷却，RT-PCR 法测定Toll 样受体 3（TLR3）mRNA、Toll 样受体 9（TLR9）mRNA 水平，确认RT-PCR 的扩增曲线和融解曲线，计算相对表达量，试剂盒由天根生化科（北京）有限公司生产。

1.4 临床疗效评价 分别于治疗3个月、6个月时检测两组患儿的临床缓解率。（1）完全缓解评价标准：患儿临床症状、体征完全消失，尿蛋白定性检测连续3次转阴（或者患儿24 h尿蛋白定量测定＜150 mg/d），人血白蛋白水平达到正常水平。（2）部分缓解判断标准：治疗后患儿的24 h尿蛋白定量较治疗前下降＞50%、人血白蛋白水平上升定义为部分缓解；（3）24 h尿蛋白定量下降＜50%定义为未缓解。

1.5 统计学方法 统计分析采用SPSS 21.0软件，两组TLR3 mRNA、TLR9 mRNA 等计量资料符合正态分布以均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验；性别、疗效、不良反应发生率等计数资料以例（%）表示，采用χ2检验或非参数检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患儿TLR3 mRNA、TLR9 mRNA 表达水平比较 治疗前，研究组和对照组患儿TLR3 mRNA、TLR9 mRNA 水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；治疗后，研究组的TLR3 mRNA、TLR9 mRNA 表达水平均低于对照组（均P＜0.05），具体见表1。

2.2 两组患儿TGF-β1 mRNA、IL-18 mRNA表达水平比较 治疗前，两组患儿TGF-β1 mRNA、IL-18 mRNA 水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；治疗后，研究组的TGF-β1 mRNA表达水平低于对照组（P＜0.05），见表2。

2.3 两组患儿临床疗效比较 在治疗3 个月后，研究组患儿的整体疗效分布优于对照组（Z=-2.070，P=0.038）；但是在治疗6 个月后，研究组和对照组患儿的整体疗效分布比较差异无统计学意义（Z=-0.951，P=0.342），详见表3。

表1 两组原发性肾病综合征患儿TLR3 mRNA、TLR9 mRNA表达水平比较（/βactin，）

表1 两组原发性肾病综合征患儿TLR3 mRNA、TLR9 mRNA表达水平比较（/βactin，）

注：对照组采用泼尼松＋霉酚酸酯治疗，研究组采用泼尼松＋环孢素A治疗；TLR3为Toll样受体3，TLR9为Toll样受体9

组别研究组对照组t值P值例数 4 8 TLR3 mRNA治疗前0.967±0.241 1.004±0.275-0.698 0.487 47治疗后0.501±0.116 0.648±0.150-5.350＜0.001 TLR9 mRNA治疗前1.983±0.447 1.890±0.433 1.030 0.306治疗后1.332±0.260 1.476±0.258-2.709 0.008

表2 两组原发性肾病综合征患儿TGF-β1 mRNA、IL-18 mRNA表达水平比较（/βactin，）

表2 两组原发性肾病综合征患儿TGF-β1 mRNA、IL-18 mRNA表达水平比较（/βactin，）

注：对照组采用泼尼松＋霉酚酸酯治疗，研究组采用泼尼松＋环孢素 A 治疗；TGF-β1 为转化生长因子 β1，IL-18 为白细胞介素-18

治疗后0.078±0.024 0.083±0.027-0.954 0.342组别研究组对照组t值P值例数 4 8治疗后0.153±0.051 0.178±0.048-2.459 0.016 TGF-β1 mRNA治疗前0.331±0.084 0.347±0.090-0.896 0.373 47 IL-18 mRNA治疗前0.173±0.052 0.168±0.050 0.478 0.634

表3 两组原发性肾病综合征患儿临床疗效比较[例（%）]

2.4 两组患儿的人血白蛋白、胆固醇水平比较 治疗前，两组患儿的人血白蛋白、胆固醇水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；治疗后，研究组的胆固醇水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表4。

表4 两组原发性肾病综合征患儿的人血白蛋白、胆固醇水平比较（）

表4 两组原发性肾病综合征患儿的人血白蛋白、胆固醇水平比较（）

注：对照组采用泼尼松＋霉酚酸酯治疗，研究组采用泼尼松＋环孢素A治疗

治疗后4.20±0.85 4.56±0.78-2.150 0.034组别研究组对照组t值P值例数48 47人血白蛋白（g/L）治疗前24.11±3.02 25.20±2.96-1.776 0.079治疗后39.75±3.30 38.81±3.42 1.363 0.176胆固醇（mmol/L）治疗前9.41±1.86 9.20±1.93 0.540 0.590

2.5 两组患儿不良反应发生情况比较 治疗后，研究组的胃肠道不适、并发感染、多毛、齿龈增生发生率与对照组比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表5。

表5 两组原发性肾病综合征患儿不良反应发生情况比较[例（%）]

3 讨 论

肾病综合征属于临床常见的儿科系统疾病，患儿由于肾小球滤过膜的通透性增加造成了大量的血浆蛋白从尿液中流失同时引发了一系列病理生理变化，PNS 属于最为常见的类型之一，超过90%以上，而且病程迁延，极易复发，严重地影响了儿童身心健康与生活质量［3］。目前认为引发肾病综合征发生的因素较多，一方面和细胞免疫有关，T 淋巴细胞是机体细胞免疫中最为主要的细胞，具有高度异质性，动物实验证实Th1 细胞参与的免疫反应主要与伴细胞增生与新月体形成有关［4-5］；生理状态下人体Th1 产生的细胞因子 IFN-γ 能够抑制 Th2 应答 ，Th2 细胞形成细胞因子IL-10 能够阻断Th1 细胞的活化，两种细胞的相互平衡制约共同维持内环境稳定，一旦失去平衡则内环境失去稳态导致疾病发生［6］。另一方面研究发现肾脏固有细胞主要为内皮细胞、足细胞以及肾小管上皮细胞，足细胞可以参与疾病发生，足细胞能够高度分化形成指突状的足突，邻近的足突之间由裂孔膜连接并紧贴在毛细血管基底膜的外侧，可以抵消肾小球基底膜膨出稳定肾小球结果，同时可以合成血管内皮生长因子维持肾脏血管滤过屏障功能，一旦足细胞损伤则血管内皮生长因子表达升高，肾脏固有细胞包括内皮细胞、系膜细胞、足细胞和肾小管上皮细胞等，研究认为足突回缩导致蛋白尿形成［7-8］。此外原位免疫复合物也会介导肾脏受损，一般情况原位免疫复合物很少进入到循环，在血流缓慢的位置沉积，肾小球系膜细胞表面存在的抗原同机体血液循环中的抗体与肾小球固有抗原相结合后沉积在肾脏系膜区后形成了原位免疫复合物，进而激活补体诱导嗜碱粒细胞释放血管活性物质进而增高血管壁的通透性，还可以释放组胺吸引中性粒细胞聚集于免疫复合物周围，最终沉积于内皮细胞与基底膜，促进了肾病综合征发生和发展［9-10］。

目前临床治疗原发性肾病综合主要以激素治疗为主，但是不良反应多，效果不佳，因此主要通过采取免疫抑制剂开展治疗，传统的免疫抑制药物副反应较大，一旦剂量过大还会引发远期不良反应增加［11］。本研究中治疗3 个月后，研究组患儿的整体疗效分布优于对照组，说明在短期内采用CsA 联合激素治疗PNS 患儿效果显著。这主要是和CsA可以参与T 淋巴细胞活化机制有关，该药物可以通过与细胞浆中的CsA 受体结合抑制钙调磷酸酶的磷酸化酶活性，进而造成了CD4+T 淋巴细胞胞浆内信号传导途径被抑制，下调细胞因子表达，同时可以纠正T 淋巴细胞比例失衡［12-13］。本研究还发现治疗后，研究组的人血白蛋白高于对照组，胆固醇水平则低于对照组，说明采用CsA 联合激素治疗PNS 患儿可以提升白蛋白浓度，降低胆固醇浓度。这主要是由于CsA 可以恢复足细胞细胞骨架的稳定性并减少蛋白尿形成，同时还可以逆转血小板活化因子对肾小球上皮细胞合成蛋白多糖的抑制，因此可以增加肾小球上皮细胞分泌硫酸类肝素和蛋白多糖形成，提升了肾小球基底膜的孔径选择性和电荷选择性，降低分流滤过，促进足突重建［14-15］。在使用CsA 应用过程中需要关注肾脏毒性，一般呈现剂量依赖性，在减量后可以恢复，其余常见的不良反应包括面部多毛、轻度高血压、呼吸道感染，少数出现肝功能异常、齿龈增生和胃肠道反应，通过开展对症处理后均无异常。研究组的胃肠道不适、并发感染、多毛表现、齿龈增生发生率与对照组比较，差异均无统计学意义，说明采用CsA联合激素治疗PNS患儿不会增加不良反应，应用较为安全。目前建议在开展CsA 治疗中应定期检测药物谷浓度，让血药谷浓度维持在100～200 μg/L，既可以确保药物治疗效果，同时也减少了不良反应发生［16］。

本研究分析了TLR3 mRNA、TLR9 mRNA变化，T淋巴细胞属于人体细胞免疫主要细胞，其中调节性T细胞参与了PNS发生和发展过程，具有维持自身免疫耐受和避免免疫损伤机体功能，但是在多种自身免疫性疾病发展中具有重要作用［17］。本研究发现治疗后，研究组的TLR3 mRNA、TLR9 mRNA表达水平均低于对照组，说明采用CsA联合激素治疗PNS患儿可以降低 TLR3 mRNA、TLR9 mRNA 表达水平，提示 PNS 发生同TLR3、TLR9 异常活化有关，通过降低 TLR3 mRNA、TLR9 mRNA表达可以减轻患者临床体征。TLRs存在于人体的单核细胞、树突状细胞等免疫细胞中，可以参与天然免疫反应和获得性免疫反应，发挥介导炎症反应作用，对病原微生物的侵袭发挥抵御作用，同时机体抗原呈递细胞如树突细胞借助其表达TLRs识别脂多糖，造成树突细胞被活化而成熟，提供获得性免疫共刺激信号［18］。TLR3 信号通路可以介导炎症反应；而TLR9则和肾脏损伤有关，通过激活细胞转录因子及黏膜免疫，造成免疫复合物在肾脏沉积，致使足细胞损伤及肾小球基质扩张，形成蛋白尿及血尿，揭示了PNS发病机制以及CsA治疗的途径［19］。本研究还发现治疗后，研究组的TGF-β1 mRNA表达水平均低于对照组，说明采用CsA联合激素治疗PNS患儿可以抑制患儿体内炎症反应程度。转化生长因子-β则在出现肾小球硬化患者中表达显著增加，会刺激肾脏局部T细胞发生转化，诱导肾脏微环境炎症因子增多，导致肾脏形成慢性炎症损伤［20］。

本研究优势在于证实了CsA 联合激素治疗PNS 患儿效果较好，同以往研究类似，但是本研究同时发现了该方案在改善患儿白蛋白浓度和降低血脂方面效果显著，而且初步阐述了发挥治疗作用同调节TLR3、TLR9 异常活化关系密切。但是本研究随访时间短，入组患者数量较少，而且各指标监测过程中受到的影响因素较多，可能导致数据存在偏倚，因此还需长期随访、扩充样本量深入观察。

综上所述，激素＋CsA 较激素＋霉酚酸酯治疗PNS 患儿对TLR3 mRNA、TLR9 mRNA、TGF-β1mRNA 的调节作用更显著，早期临床效果更好。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。