手持式猪精子密度仪在牛精子密度测定中的应用

李安定，杨兆馨，高亚楠，刘海林，李闯，蒋桂韬，燕海峰*

(1. 浏阳市农业发展事务中心，湖南 浏阳 410300；2. 湖南省畜牧兽医研究所，湖南 长沙 410131；3. 东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

动物精子密度是精液质量的重要评价指标[1]，在人工授精技术、利用冷冻精液保存动物遗传资源与杂交改良、动物繁殖性能评价等方面有重要的作用[2-3]。目前常用的精子密度测定方法有：目测估计法，简单廉价但主观性强；血细胞计数板法，是精子密度判定的唯一客观方法，但操作繁锁且要求非常熟练才准确[4-5]；计算机辅助分析法，设备与耗材昂贵，且操作技术要求高；吸光度法，相对简单、快捷，成本较低，结果也相对准确。吸光度法(包括分光光度计、密度仪等)测定精子密度，主要是用特定波长的光照射精液后，检测该光被吸收的程度来实现。精子越多，吸光度就越大，建立精液吸光度与精子密度之间的这种函数关系后，就能通过测定的吸光度来计算出精子密度。吸光度法已广泛应用到猪、俄罗斯鲟、蟹类、狐等的精子密度测定中[6]。

精子密度仪是把吸光度与精子密度的函数关系，利用计算机技术植入仪器，测定时可以直接读取被测物质精子密度的仪器，省去通过吸光度查找，或者计算精子密度的步骤。进口的精子密度仪(如minitube SDM1)使用成本高，且一般限定只能检测一种动物，只能读取精子密度，不能读取吸光度，因此不能根据用户的需求建立针对性强、更准确的精液吸光度-精子密度函数，很难实现一机多用。国产的精子密度仪大部分是用坐标描图的方式查出结果。此外，在建立精液吸光度-精子密度函数的方法方面，不同研究报道差别很大，缺乏简单、规范的方案。

朱利琴等[6]利用分光光度计和手持式猪精子密度仪对鸡精子密度进行测定，但检测样品所用的稀释液(简称“检测液”)是3%的NaCl溶液，该液需要专门配制且浪费大。高亚楠等[7]报道，手持式猪精子密度仪检测鸡精子密度，用商品化的0.9% NaCl溶液代替3.0% NaCl溶液作为稀释液可行，鸡0.9% NaCl的精子密度-精液吸光度函数为Y=-0.264X3+1.23X2+0.468X+0.019 (R2=0.999)，且鸭3.0% NaCl的精子密度-精液吸光度函数为Y=1.283X3-0.99X2+0.994X-0.009 (R2=0.996)，与鸡的非常相似。

本文建立了利用手持式猪精子密度仪简单快捷测定牛精子密度的方法，为实现一机多用，降低动物精子密度仪购买成本，高效经济地测定动物精子密度等提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

种公牛，饲养于湖南省家畜育种工作站；手持式猪精子密度仪(型号为TY-8018)，北京田园奥瑞生生物科技有限公司生产；稀释液为0.9%的NaCl溶液(250 mL)，武汉滨湖双鹤药业有限责任公司生产[7]；3.0%的NaCl溶液为自行配制。

1.2 方法

1.2.1 牛精液稀释倍数-吸光度检测

在不影响种公牛冻精生产的同时，于2019年3至4月，选健康、圈养的13头西门塔尔牛(其中9岁的4头、2.5岁的9头)、5头安格斯牛(其中6岁的红安格斯2头、2.5岁的黑安格斯3头)、3头6岁的利木赞牛和7头4岁的荷斯坦奶牛，共28头种公牛用于采精。每头牛每周采精2～4次，保证精液样品无尿液、血液等污染物，采精量平均每头为0.4 mL，用离心管收集多头牛精液至4～5 mL，颠到混匀。

密度仪开机稳定后，取2 000 μL 0.9% NaCl稀释液于干净待用的比色皿中，将比色皿放入手持式猪精子密度仪中，调零；用移液器吸取待测精液样品200 μL，于含2 000 μL稀释液的比色皿中(该过程待测样品的稀释倍数为11倍)，同时将移液器的枪头浸入液体深处，分别在比色皿4个角落反复吹打1～2次后，压住比色皿口，颠倒混匀3次左右，立即检测吸光度。

根据上述所测样品的吸光度及其稀释倍数，估算出建立与验证曲线函数所需0.1、0.3、0.5、0.7、0.9等吸光度精液样品的稀释倍数。再从混合精液中分别取样，根据估算的稀释倍数分别进行稀释，分别获得0.1、0.3、0.5、0.7、0.9等吸光度对应的精液样品。高倍稀释需分2步进行，每步取样量大于50 μL。每个倍数取原精制作平行样，每个平行样读取3次吸光度，得到牛精液稀释倍数-吸光度表。试验于不同日期进行9个批次的试验。

1.2.2 牛精液精子密度检测

以上9个批次的牛精液，每个批次均用3% NaCl稀释到适合计数的稀释倍数(一般为121倍，吸光度为0.1左右)，用血细胞计数板法获得精子密度，方法见参考文献[7]。计数时取原精制作3个平行样，每个平行样检测3次以上(即重复数为9次)，通过计数密度推算出其他稀释倍数样品的精子密度，得到用于函数建立与验证所需的精液吸光度-精子密度数据表。

1.2.3 牛精液吸光度-精子密度函数的建立、验证与完善

上述9个批次试验，前6个批次的数据用于建立函数，后3个批次的数据用于验证函数。最后，为增加函数的可靠性，将9个批次数据汇总再次建立牛精液吸光度-精子密度函数。

1.2.4 数据统计与分析

用Excel软件和SPSS 24.0软件，分析和拟合牛精液吸光度-精子密度函数，建立回归方程；用SPSS 24.0软件，对函数计算密度和计数密度数据进行配对样品t检验的差异显著性分析。 数据以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 牛精液吸光度-精子密度数据

前6个批次牛精液吸光度测定，稀释倍数在11～165倍，精液吸光度在0.1～1.176之间(见表1)。

表1 不同批次牛精液吸光度-精子密度测定(0.9% NaCl)

由表1可见，以0.9% NaCl为稀释液对牛精液样品分别稀释11～165倍，用计数板法测定精子密度，计数密度在0.053亿/mL～1.148亿/mL 之间。由表2可见，以3% NaCl为稀释液对牛精液样品进行精子密度测定(函数建立测定6次，验证测定3次)，计数的平均变异系数为9.64%，但稀释88倍、165倍和其中2次121倍的变异系数大于10%，9个批次牛精子密度范围在8.215亿/mL～12.631亿/mL。

2.2 牛精液吸光度-精子密度函数的建立与验证

前6个批次的数据(见表1)拟合出精液吸光度-精子密度回归方程，为Y6=0.404X3-0.115X2+ 0.487X+0.06(R2=0.982)。

后3个批次通过配对样品t检验，发现吸光度在0.108～1.131之间，函数密度与计数密度无显著差异(P>0.05)，平均相对误差为9.5%，可以采用本研究的仪器、方法与函数来计算牛精液的精子密度。4月24日5种倍数的数据相对误差均超过10%，剔除该天的数据后，函数多次测定样品的平均相对误差为5.61%(见表3)。

表2 不同批次牛精液计数板法测定精子密度(3% NaCl)

表3 不同批次牛精液吸光度-精子密度函数的验证(n=12)

2.3 牛精液吸光度-精子密度函数的完善

将9个批次的数据汇总，拟合函数方程为Y=0.403X3-0.165X2+0.533X+0.001(R2=0.980)，曲线见图1。

牛0.9% NaCl曲线为本试验结果，其余曲线数据来源于参考文献[7]

3 讨论

3.1 精子密度仪的选择与使用

目前动物精子密度仪主要为猪的，其中原装进口的已把精液吸光度-精子密度函数植入仪器，读数直接显示精子密度。这些进口密度仪也存在一些不足：1)无法修改函数，也不显示吸光度，只能适应某一种动物，通用性不强；2)无法用精子计数等方法校正，影响仪器的准确性；3)大部分仪器使用的是专用样品池，使用成本高。国产的精子密度仪大部分需根据“精液吸光度-精子密度表”查询结果，同样这个数据表的通用性与准确性也值得考虑。

本文中手持式猪精子密度仪，内置的是猪精液吸光度-精子密度函数，检测液不清楚，初次在湖南地方猪精子密度测定中使用，误差较大。该密度仪使用的是通用比色皿，购买容易且价格低，方便检测大量样品，而且同时显示密度与吸光度，给仪器校正与实现一机多用提供了可能。另外，该仪器在样品测定结束后，应立即将比色皿取出，因为比色皿室盖上后看不见里面是否有样液，同时手持式猪精子密度仪不大，很容易在忘记拿出样品液时整理仪器，导致样品液泼洒在比色皿室内，损坏仪器。

3.2 精子密度仪标准曲线的建立方法

目前标准曲线使用的检测液有双蒸水、3% NaCl、2.9%柠檬酸钠等，其中双蒸水、3% NaCl等能杀死精子，精子在其中的均匀度可能受影响，测定时对混匀程度以及混匀后多久进行测试都有较高的要求。而用0.9% NaCl时，精子活力很长时间不会下降，可以减轻这种精子难混合均匀的影响，同时0.9% NaCl相对廉价且容易购买[7-8]。

已有报道，关于牛精液吸光度-精子密度标准曲线的建立，精液样品的获得全部是随机采取单只牛精液，要得到0.1～1.0多种吸光度的精液样品，且使样品具有代表性，则需要很多牛只，难度很大[9-16]。高亚楠等[7]采取多个动物的混合精液，通过稀释得到所需不同吸光度的精液样品，只计数1个适合计数的稀释倍数(即吸光度为0.1左右)样品的密度，然后由这个计数密度推算其他稀释倍数样品的密度，建立了家禽精液吸光度-精子密度标准曲线，降低了难度[7]。

3.3 畜禽精液吸光度-精子密度测定方法的准确性

在早期的牛精液吸光度-精子密度研究中，很少有已经置入函数的精子密度仪，主要采用的是分光光度计，且有直线、对数曲线、二次曲线等函数关系[9-16]。另外，还发现用同一研究的计数密度与函数密度差异不显著，但不同研究者即使采用同一型号的仪器与相似的条件，函数也有直线与二次函数的差异[14-15]。

高亚楠等[7]报道，不同研究者使用同一仪器、同样的方法获得的吸光度-精子密度曲线类似，均为三次函数，但不同物种、不同检测液的曲线有较大差异，牛的精子密度相对于其他3种动物是最低的，精子密度越小曲线越平坦。当吸光度在0.5以下时，几种曲线几乎都接近直线，尤其是鸡、鸭的曲线，几乎重合(如图1)，这也许是很多研究报道吸光度在0.5以下测定相对更准确，以及很多报导曲线为一次函数的原因。此外也提示，可以研发出畜禽精子密度测定通用仪器，但要统一检测液与限定吸光值范围。

黄红卫[17]用进口分光光度计对20份水牛精液样本(其中摩拉水牛l2份，尼里/拉菲水牛8份)进行检测，并与国产型分光光度计、血细胞计数板的检测结果进行比较，发现差异不显著。赵鹏等[18]检测北京奶牛中心提供的50头份牛冷冻精液，发现人工计数法的检测结果(0.12亿/mL)与进口精子质量计算机辅助精液分析(CASA)系统检测结果(0.11亿/mL)之间差异不显著。

有报道，待测样品稀释后到测定的时间间隔、待测样品在比色皿中的混匀方式、稀释液的种类与稀释倍数等均对吸光度有显著影响，移液器取样方法、待测样品进入比色皿(一般是11倍稀释)后的混匀方式对结果有显著影响[7-8]。此外， 血细胞计数板计数法随机误差较大, 每次计数值都可能有较大的差异，操作者熟练与不熟练，相对误差分别为10.11%与19.55%[19]。这也许就是以上研究出现分歧的原因。本文在此基础上对待测样品吸入比色皿后的混匀方式进行了改进，方法的精度与可操作性上取得了较好效果。

然而，以上所有研究没有讨论所建立的精液吸光度-精子密度曲线的校正问题、使用的准确性以及长期使用后的稳定性等，而这些恰恰是精子密度仪推广应用的前提。由于将校正与函数计算等程序置入密度仪有一定的难度，可以将以上函数计数开发为用手机APP来简化。

本文选用了小巧实用的手持式猪精子密度仪，简化了精液吸光度-精子密度函数建立方法，获得了简单快捷、相对准确的牛精子密度测定方法。建立的牛精液吸光度-精子密度为三次函数，Y=0.403X3-0.165X2+0.533X+0.001(R2=0.980)，将读取的待测样品吸光度代入方程，计算值乘以待测样品总的稀释倍数，即原精到待测样品的稀释倍数(如果不必稀释则乘以1)与待测样品加到比色皿中产生的稀释倍数(一般为11倍)二者的乘积，即可得到原精样品的精子密度，单位为亿/mL。