四川省理塘县牦牛感染泰勒虫的分子流行病学调查及虫种鉴定

李友英，蓝岚，潘瑶，3，杨丹娇，吴建平，李松明，程川，王德云*

(1. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095；2. 甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所，四川 甘孜 626000；3. 西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041；4. 理塘县动物疫病预防控制中心，四川 理塘 624300)

梨形虫病是由梨形虫寄生于牛羊等动物红细胞及网状内皮细胞内引起的一种蜱传寄生虫病[1-2]，临床症状主要以发热、黄疸、贫血、血红蛋白尿等为主，发病率和死亡率高，给养殖户造成巨大损失[3-5]。迄今为止，发布的牛梨形虫病病原主要有牛巴贝斯虫(BabesiaBovis)、双芽巴贝斯虫(Babesiabigemina)、分歧巴贝斯虫(Babesiadivergens)、卵形巴贝斯虫(Babesiaovalis)、大巴贝斯虫(Babesiamacrocephala)、东方泰勒虫(Theileriaorientalis)、环形泰勒虫(Theileriaannulata)、小泰勒虫(Theileriaparva)、中华泰勒虫(Theileriasinensis)和瑟氏泰勒虫(Theileriasergenti)等[6-8]。青藏高原地区，感染牦牛与藏绵羊的泰勒虫主要有中华泰勒虫(Theileriasinensis)、环形泰勒虫(Theileriaannulata)、东方泰勒虫(Theileriaorientalis)、绵羊泰勒虫(Theileriaovis)、吕氏泰勒虫(Theilerialowenshuni)等[8-9]。本病需通过蜱吸食牛羊的血液进行传播，该病的流行与当地蜱的消长、活动密切相关，具有明显的季节性[10-11]。了解其流行规律可制定相应的防治措施预防控制该病。

牦牛是甘孜州畜牧业的主要养殖品种，是高原地区牧民的主要经济动物，甘孜州辖18 个县，其中理塘为五大牧区县之一，牦牛为其优势畜种[12-15]。牦牛梨形虫病是危害牦牛养殖业的主要寄生虫病之一[12]。拥崩扎[16]调查发现牛梨形虫病不受年龄限制，以2 岁内的牛发病最多，但症状轻，死亡率较低；成年牛发病率较低，但病情严重，死亡率达70%～80%。2018年我们对甘孜藏族自治州(甘孜州)全部18个县(市)牦牛梨形虫的感染情况进行调查，采集牦牛全血1 381 份，梨形虫平均阳性率高达31.72%，泰勒虫占比86.29%；其中理塘县达30.68%，泰勒虫占比90%，说明理塘县牦牛感染泰勒虫情况较为严重。该病是造成全州牦牛夏秋季死亡的主要疫病之一[17]，但一直未有对甘孜州牦牛泰勒虫流行规律的确切报道。本试验通过分析理塘县牦牛泰勒虫感染的季节规律、年龄段、性别特点、体重变化及优势虫种鉴定，对理塘县牦牛感染泰勒虫的流行规律进行调查，对指导牦牛梨形虫病防治，提高畜牧业经济效益，促进农牧民增收具有重要指导意义。

1 材料与方法

1.1 牦牛血样采集

2019年5—11月和2020年4—10月定点从理塘县多个牧场采集临床健康且未驱虫牦牛全血345 份，标记时间、年龄、体重及性别，装于一次性真空抗凝管中，置冰盒带回实验室检测。所有的血样均放在-20 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 全血总DNA提取

吸取150 μL全血加入离心管中，然后采用酚-氯仿法提取DNA，置于抗凝管中2～8 ℃保存。

1.2.2 18S rRNA引物的设计

采用文献[18]报道的以18S rRNA为靶基因的梨形虫巢式PCR方法进行检测。引物信息见表1。

表1 引物信息

1.2.3 梨形虫18S rRNA序列的PCR扩增

第一轮反应：PremixTaq酶(购自 TaKaRa 公司)12.5 μL，外引物F/R各1 μL(10 μmol/μL)，样本DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸7 min；16 ℃反应结束。第二轮反应：PremixTaq酶12.5 μL，内引物 F/R 各1 μL(10 μmol/μL)，第一轮PCR产物1 μL，ddH2O 9.5 μL。95 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环；72 ℃延伸10 min；16 ℃反应结束。将第二轮PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4 虫种鉴定

将全部牦牛梨形虫核酸阳性样本共计65 份的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。通过NCBI上的BLAST对序列进行比对。采用MEGA 7软件以Neighbor-Joining法(Bootstrap值为1 000)基于梨形虫序列构建系统进化树，运用Lasergene 7.0软件对所测得的序列进行同源性比对分析，根据构建的进化树及同源性分析结果鉴定泰勒虫虫种。

1.3 数据统计与分析

采用 IBM SPSS Statistics 20 软件进行方差分析和多重比较。试验数据以“平均值±标准误” 表示。

2 结果与分析

2.1 理塘县牦牛泰勒虫检测

理塘县采集血样345 份，经巢式PCR扩增其18S rRNA部分基因序列，其中有65份样本扩增出目的条带，泰勒虫阳性率为18.84%。部分样本PCR电泳结果见图1。

M.D2000 DNA Marker；P.阳性对照；N.阴性对照(去离子水)；1～12.牦牛全血样本

2.2 牦牛感染泰勒虫的季节规律

5、6月牦牛泰勒虫阳性率较高，高于其他月份，分别为30.00%(12/40)、29.03%(18/62)。最低为11 月，阳性率为8.7%(65/345)。见表2。

表2 牦牛感染泰勒虫的季节规律

2.3 不同年龄段牦牛泰勒虫的感染情况

0～2岁组牦牛泰勒虫阳性率为 19.70%(13/66)，2～5岁组为24.67%(37/150)，5岁以上组为11.63%(15/129)。0～2岁与2～5岁组牦牛泰勒虫阳性率显著高于5岁以上组(P<0.05)。见图2。

字母不同表示差异显著 (P<0.05)，字母相同表示差异不显著 (P>0.05)

对同一年龄组的泰勒虫阳性牦牛与阴性牦牛的平均体重进行分析，0～2 岁组，泰勒虫阳性牦牛平均体重低于阴性牦牛，差异不显著(P>0.05)；而2～5 岁组、5 岁以上组泰勒虫阳性牦牛平均体重显著低于对应的阴性牦牛(P<0.05)。说明感染泰勒虫的牦牛体重普遍较低。

同一年龄组进行性比较，字母不同表示差异显著 (P<0.05)，字母相同表示差异不显著 (P>0.05)

2.4 不同性别牦牛泰勒虫的感染情况

由表3可知雄性牦牛泰勒虫阳性率为19.34%(41/212)，雌性牦牛为18.05%(24/133)，雄性牦牛泰勒虫阳性率稍高于雌性牦牛，但差异不明显。

表3 不同性别牦牛泰勒虫的感染情况

2.5 牦牛泰勒虫种鉴定

2.5.1 牦牛泰勒虫虫种检测

将全部牦牛梨形虫阳性样本PCR产物测序鉴定，成功测序58 份，鉴定得到2 个虫种。其中中华泰勒虫占比为98.28%(57/58)，吕氏泰勒虫占比为1.72%(1/58)。各月泰勒虫虫种情况详见表4。

2.5.2 分子种系发育分析

基于梨形虫18S rRNA基因序列建立进化树进行牦牛泰勒虫虫种鉴定。由图4可见，理塘县检测出的57 株序列(Yak1～55、Litang-5-4、Litang-5-5)与GenBank中已发表的中华泰勒虫甘肃、河南分离株(EU274472.1、KF559355.1、KX115427.1)之间的同源性为94.60%～100.00%，聚为一大枝，57株序列间同源性为92.9%～100.00%，鉴定为中华泰勒虫。理塘检测出的1 株序列(Litang-5-7)与已发表的吕氏泰勒虫甘肃分离株(JX469521.1、JX469527.1、JF719833.1)之间的同源性为99.70%～100.00%，聚为一大枝，鉴定为吕氏泰勒虫。

表4 牦牛泰勒虫虫种检测结果

Yak1～55代表中华泰勒虫55个样本序列，▲代表其他样本序列

3 讨论

巢式PCR较常规PCR方法特异性更高，可用于诊断亚临床感染[19-22]。Mahmoud等[23]使用间接荧光抗体试验方法 (IFAT)及巢式PCR方法对驴和马的血液寄生虫感染情况进行检测，IFAT的检出率低于巢式PCR。18S rRNA具有保守性和高变性，不仅能检测出是否有梨形虫感染，还可通过梨形虫核酸阳性样本进行PCR产物测序，基因序列构建系统进化树进行虫种鉴定。沈雪鹰等[24]采用18S rRNA为靶基因的套氏PCR检测云南省腾冲市牛羊梨形虫的感染情况，采集758头牛、羊的血样，总阳性率27.31%，检出虫种包括巴贝斯虫和泰勒虫两属13种，牛感染6种泰勒虫和4种巴贝斯虫，羊感染3种泰勒虫和2种巴贝斯虫。蓝岚等[17]采用18S rRNA为靶基因的梨形虫巢式PCR方法，对1 381份牦牛全血进行梨形虫检测，梨形虫平均阳性率为31.72%，包括巴贝斯虫和泰勒虫两属，鉴定虫种6个。18S rRNA基因作为分子标记以及其测序方法具有较高的检出率和准确率，在牦牛和藏绵羊的梨形虫检测中应用广泛且效果良好[25-27]。本试验采用以18S rRNA为靶基因的梨形虫巢式PCR方法，对四川省理塘县牦牛泰勒虫病原进行检测，并通过构建系统进化树及同源性分析进行虫种鉴定。

拥崩扎[16]对甘孜州乡城县牛双芽巴贝斯焦虫病的流行病学进行调查，发现该病在乡城县12个乡(镇)时有发生，主要发生在夏秋季节，以7—10月份为发病高峰期，12月份有极少数牛发病。Li等[6]于2015年4—7月，对甘肃天祝白牦牛350份血样进行检测，梨形虫阳性率为38.3%，鉴定虫种4个，中华泰勒虫、东方泰勒虫、双芽巴贝斯虫、牛环形泰勒虫、阳性率分别为26.0%、9.7%、8.3%、7.7%。钟维等[27]于2016年9—10月，对采自四川阿坝州5个县牦牛梨形虫进行检测，牦牛梨形虫感染率为8.3%～100%，感染虫种单一，均为中华泰勒虫。刘道鑫[28]调查发现青海天峻地区牦牛泰勒虫感染率为24.18%，2～3岁组感染率最高，为29.86%。甘孜州牦牛泰勒虫感染情况较为严重，然而，到目前为止，一直未见对甘孜州牦牛感染泰勒虫的季节、年龄、体重、性别等规律的确切报道。本试验基于这一现状，采集不同月份牦牛血样，对理塘县牦牛泰勒虫感染季节规律、年龄段、性别特点、虫种进行调查。结果发现泰勒虫平均阳性率为18.84%，5、6月牦牛泰勒虫阳性率明显高于其他月份，2～5岁组牦牛泰勒虫阳性率最高，显著高于5岁以上组牦牛，与0～2岁组牦牛差异不显著；公牦牛感染率略高，差异不显著。鉴定牦牛泰勒虫虫种2个，其中中华泰勒虫占比为98.28%，吕氏泰勒虫占比1.72%，结果表明中华泰勒虫为理塘县牦牛感染的优势虫种。该调查为理塘县梨形虫病流行的预防及控制提供依据，在提高牦牛的生产性能方面，需要考虑梨形虫感染造成的影响。

本次调查仅在5月份检测出了吕氏泰勒虫，检出率较低。蜱是梨形虫病原传播的关键环节。吕氏泰勒虫主要以青海血蜱为宿主。唐天才[29]自甘孜州石渠县采集蜱虫1 352只，鉴定为青海血蜱和西藏革蜱，其中青海血蜱占29.13%；西藏革蜱占70.87%，优势种。该调查发现，青海血蜱仅分布于海拔相对较低的半农牧区的3个乡。理塘县属于纯牧业区，采样地海拔均高达4 000 m，而青海血蜱主要分布于海拔相对较低的半农牧区，推测其为吕氏泰勒虫检出率较低的原因。但有关理塘县蜱的种类及携带病原情况的资料几乎为零，且青藏高原地区牦牛感染吕氏泰勒虫的报道相对较少。除此之外，本次调查仅对理塘县部分地区进行调查，所以其流行规律及机制尚待进一步深入研究。

梨形虫病临床特征以高热、黄疸、贫血、消瘦和血红蛋白尿为主，严重者可导致宿主死亡，亚临床感染可出现牦牛产肉量下降、生长发育迟缓、繁殖性能下降等[5,27]。本次检测牦牛均未发现有明显的临床症状，但是体重普遍偏轻，大大降低了牧民的经济收入，应该引起高度重视，做好各项预防工作，将农牧民的财产损失降到最低。

本次调查发现理塘县牦牛泰勒虫5、6月感染情况较为严重，可能与其所在地理位置有关。理塘县境内地表平均海拔4 300 m左右，5—10月降水量集中，气温相对较高；11月至次年4月，气候干燥寒冷，多大风天气，11月至次年3月平均气温多在0 ℃以下。每年5—6月份气温开始升高，植被增多，蜱虫开始活跃，增加了蜱侵袭牦牛和传播梨形虫的机会，所以应在每年多发季节前进行预防性给药和灭蜱工作。此次调查表明，不同年龄的牦牛感染阳性率不同，且2～5岁组的牦牛感染阳性率较高，为23.46%。因此，不同年龄的牦牛防治措施应该不同，应加强对2～5岁龄牦牛梨形虫病的防治，这样才能有效减少该病的感染率。

本研究首次对理塘县牦牛感染泰勒虫的流行规律进行调查，该县牦牛泰勒虫感染率较高，平均阳性率为18.84%，5、6月明显高于其他调查月份；2～5岁组牦牛显著高于0～2岁组牦牛，公牦牛感染率较高，优势虫种为中华泰勒虫，为理塘县牦牛梨形虫病防控提供了重要参考。梨形虫病的主要传播媒介为蜱，但本试验未对蜱的种类和分布进行调查，还需进一步调查研究。