牛磺酸对脂多糖引起的奶牛肝脏原代细胞炎症的保护作用

张宏竹,汪艳,常广军,沈向真

(南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095)

奶牛肝脏炎症是一种临床上常见的疾病，通常是由于瘤胃中的pH降低引起革兰阴性菌裂解，继而释放大量脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，透过瘤胃壁经血液循环进入肝脏所导致[1-3]。LPS进入肝脏后，会被细胞表面的Toll样受体4(TLR4)识别，继而引起核因子κB (NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等一系列下游信号通路的激活，激活的NF-κB进入细胞核内，与炎症相关基因的启动子区域结合，调控其转录，促进白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)等炎性相关基因的表达[4]。本实验室前期研究证明，LPS能够引起奶牛肝脏原代细胞(BHEC)炎症以及脂肪酸代谢紊乱[5]，对奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激和凋亡同样具有促进作用[6-7]。瘤胃来源的LPS也被证明和多种奶牛疾病有关，给奶牛养殖业带来巨大经济损失[8]。

牛磺酸(taurine，TAU)是一种动物机体内普遍存在的游离氨基酸，在许多生物进程中发挥重要作用[9]。研究表明牛磺酸对于减轻细胞损伤效果显著，赭曲霉素A引起的猪肾细胞凋亡和自噬在添加牛磺酸保护后被显著抑制[10]；同时牛磺酸能够缓解LPS引起的小鼠乳腺上皮细胞炎症反应[11]。但是牛磺酸是否可以用于保护LPS引起的BHEC炎症反应目前尚不清楚。本文旨在探究牛磺酸预处理对LPS引起的BHEC炎症反应的保护及相关信号通路的调控作用，为临床上治疗奶牛肝脏炎症提供一种可行的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

LPS、牛磺酸，购自Sigma公司；RNA iso Plus，购自TaKaRa公司；DMEM/F12细胞培养基，购自Gibco公司；荧光定量、反转录试剂盒，购自南京市诺唯赞Vazyme生物科技股份公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自Thermo fisher公司；细胞增殖及毒性检测(CCK-8)试剂盒、蛋白提取试剂盒，购自北京索莱宝生物科技公司；聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶快速制备试剂盒、三色预染蛋白Marker、ECL发光液，购自上海雅酶生物科技公司；蛋白上样缓冲液，购自Biosharp公司；核因子κB 亚基P65(P65)兔单克隆抗体、磷酸化核因子κB 亚基P65(p-P65)兔多克隆抗体、核因子κB 抑制蛋白(p-IκB)兔单克隆抗体、磷酸化核因子κB 抑制蛋白(IκB)兔单克隆抗体、TLR4兔多克隆抗体，购自碧云天生物科技有限公司。

LPS溶液配制：称取10 mg LPS粉末加入5 mL超纯水稀释配置成浓度为2 mg/mL的LPS溶液，用孔径0.22 μm的无菌滤器过滤，放置于-20 ℃保存；牛磺酸溶液配置：称取5 g牛磺酸粉末加入200 mL PBS缓冲液，溶解后用0.22 μm无菌滤器过滤配置成浓度为200 mmol/L的牛磺酸溶液。

1.2 BHEC的分离与培养

采用活体穿刺法从泌乳中期荷斯坦奶牛(产后160 d左右)体内采集1～3 g肝组织，浸泡在70%乙醇中短暂消毒后，放入装有5 mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和0.05 mol/L 2-氨基乙基醚(EGTA)的10 mL无菌试管中运输保存。待返回试验室，用手术刀将肝组织切成小块，加入适量不含Ca2+和Mg2+的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)溶液，1 000 r/min离心3 min，再用50 mL含1 mmol/L CaCl2和150 U/mL Ⅰ 型胶原酶的HBSS重悬。放入无菌培养箱中缓慢摇动，37 ℃孵育40 min。待孵育结束，加入25 mL含10%胎牛血清的培养基中和胶原酶。用200目细胞过滤器过滤细胞悬液，PBS洗涤3次，用完全培养基(含有10% FBS、1 nmol/L胰高血糖素、10 nmol/L地塞米松、10 ng/mL表皮生长因子、10 nmol/L胰岛素、90% 基础培养基以及1%青链霉素)重悬，以每瓶3×105密度接种在T75培养瓶中。放入5% CO2、37 ℃培养箱中培养。本试验中使用的细胞均为第6～8代。

1.3 试验分组

12孔板中每孔接种3×105个细胞，待到细胞密度达到80%时，添加不同试剂进行处理，试验分为4组，即PBS处理6 h的对照组(CON)、牛磺酸处理6 h组(TAU)、LPS处理6 h组(LPS)、牛磺酸预处理6 h后更换为LPS处理液处理6 h组(LT)。

1.4 细胞活力测定

96孔细胞培养板每孔接种1×104个细胞，使用牛磺酸或LPS分别处理6 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育4 h，酶标仪450 nm测吸光度。细胞活力的计算公式为：细胞活力=(OD处理组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。其中处理组，添加细胞、CCK-8溶液以及LPS处理液；对照组，添加细胞和CCK-8处理液；空白组，添加CCK-8溶液和LPS处理液。

1.5 RNA提取和荧光定量PCR反应

12孔板每孔加入1 mL RNA iso Plus，根据说明书提取细胞总RNA，测定浓度并反转录合成cDNA。采用SYBR Green相对荧光定量PCR方法，使用ABI 7300实时荧光定量系统，反应体系为20 μL，包含SYBR 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、cDNA 2 μL、超纯水7.2 μL。采用两步扩增法，反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每个样品做2个重复，以GAPDH为内参。所得数据采用 2-ΔΔCt法。RT-qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物列表如表1。

1.6 Western blot检测

细胞总蛋白使用蛋白提取试剂盒提取，BCA法测定蛋白浓度后，各样品稀释成统一浓度。使用10% SDS-PAGE分离蛋白后，将分离胶上的蛋白转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(孔径：0.22 μm)上，转印完成后，磷酸化蛋白使用5% BSA封闭2 h，其余蛋白采用5%脱脂牛奶封闭，一抗4 ℃孵育12 h，二抗室温孵育1 h，用ECL发光液显影。

1.7 免疫荧光

细胞接种于爬片上，处理完成后用PBS清洗，4%多聚甲醛固定细胞，0.1%～0.25% Triton X-100孵育15 min，封闭30 min后，一抗4 ℃孵育过夜，PBS清洗后二抗37 ℃孵育1 h，PBS清洗后DAPI染色5 min，用抗荧光淬灭剂将爬片倒扣在载玻片上，共聚焦显微镜下观察结果。

1.8 数据统计与分析

分别采用Graphpad prism 8.0和IBM SPSS Statistics 21进行作图和数据分析，单因素方差分析(One-way ANOVA)，Dunnett法比较组间均值，所有结果以“平均值±标准误”表示。

表1 引物序列

2 结果与分析

2.1 细胞活力测定

分别用不同浓度的LPS和牛磺酸处理细胞6 h，结果如图1所示，当LPS和牛磺酸的浓度分别大于12 μg/mL和20 mmol/L时，细胞活力出现显著下降(P<0.05)，所以分别选取浓度为2、4、8、10、12 μg/mL的LPS和5、10、15、20 mmol/L的牛磺酸进行后续试验。

与对照组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。下同

2.2 LPS和牛磺酸最佳处理浓度的确定

如图2所示，不同浓度梯度的LPS处理细胞后，IL-8的mRNA表达量均极显著上升(P<0.01)，而P65的表达量在LPS浓度为2 μg/mL时显著上升(P<0.05)，其余浓度无显著性变化(P>0.05)。不同浓度的牛磺酸预处理细胞后，使用浓度为2 μg/mL的LPS处理，基因表达结果如图3所示，与LPS处理组相比，浓度为10 mmol/L的牛磺酸预处理细胞后，IL-8的基因表达无显著下调(P>0.05)，P65的基因表达极显著下调(P<0.01)，其余各浓度牛磺酸均能使IL-8和P65的表达量显著下调(P<0.05)。因此采用浓度为2 μg/mL的LPS和20 mmol/L的牛磺酸进行后续试验。

2.3 牛磺酸预处理对LPS引起的BHEC炎症相关基因表达变化的影响

荧光定量PCR结果如图4A所示，与对照组相比，LPS组的炎性因子IL-6和趋化因子IL-1β、IL-8的基因表达极显著升高(P<0.01)；对照组和TAU组之间IL-6、IL-8的表达量无明显差异(P>0.05)；与LPS组相比，LT组的IL-6、IL-8表达量极显著降低(P<0.01)，IL-1β表达量显著降低(P<0.05)。

图2 不同浓度LPS引起的BHEC炎症基因变化

与LPS组相比，#表示差异显著(P<0.05)，##表示差异极显著(P<0.01)。下同

2.4 牛磺酸预处理对LPS引起的BHEC内NF-κB通路相关基因mRNA水平的影响

如图4B所示，LPS组中的P65 mRNA表达量极显著高于对照组(P<0.01)，TLR4 mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05)；而添加牛磺酸保护后，与LPS组相比，LT组中的P65 mRNA表达量极显著下降(P<0.01)，TLR4 mRNA表达量显著下降(P<0.05)；各组中IκB mRNA表达差异不显著(P>0.05)。

2.5 牛磺酸预处理对LPS引起的BHEC内TLR4-NF-κB通路相关蛋白表达的影响

通过Western blot测定细胞总蛋白中p-P65、P65、p-IκB、IκB、TLR4的表达水平，结果如图5所示。与对照组相比，LPS组中的p-P65/P65、p-IκB/IκB表达量极显著升高(P<0.01),TLR4表达量显著升高(P<0.05)，TAU组中的p-P65/P65、p-IκB/IκB、TLR4表达无显著差异(P>0.05)。在添加了牛磺酸保护后，相比于LPS组，LT组中的p-P65/P65表达量显著下降(P<0.05)，p-IκB/IκB表达量极显著下降(P<0.01)，TLR4表达量显著下降(P<0.05)。

图4 牛磺酸预处理对LPS引起的BHEC炎症基因(A)和TLR4-NF-κB通路相关基因(B)mRNA水平的影响

2.6 免疫荧光检测P65蛋白在细胞中的定位

免疫荧光结果如图6所示，与对照组相比，LPS刺激后，细胞核内的P65含量明显升高，而添加了牛磺酸保护后，与LPS组相比，细胞核内P65的含量明显下降，说明了牛磺酸预处理减少了LPS引起的P65的入核，抑制了NF-κB信号通路的激活。

图5 牛磺酸预处理对LPS引起的BHEC内TLR4-NF-κB通路相关蛋白表达的影响

图6 牛磺酸预处理对LPS引起的BHEC中P65入核情况的影响(标尺=20 μm)

3 讨论

亚急性瘤胃酸中毒(SARA)发生时，瘤胃内pH下降，造成大量革兰阴性菌裂解，释放大量LPS，经血液循环进入肝脏、乳腺等器官，继而导致肝脏炎症、乳腺炎、蹄叶炎等疾病的发生[12]，给奶牛养殖行业带来巨大经济损失。大量试验表明，LPS可以引起奶牛肝脏细胞损伤以及代谢紊乱。经门静脉进入肝脏的LPS可以诱导奶牛肝脏组织炎症及凋亡的发生[6,13]。本试验采用了Xu等[5]报道的方法分离BHEC，并分别添加牛磺酸和LPS处理，成功建立奶牛肝脏炎症体外模型，对牛磺酸调控LPS引起的BHEC炎症进行研究。

TLR4是细胞表面的一种模式识别受体(PRRs)，在天然免疫过程中发挥重要作用[14]。LPS被细胞表面的TLR4识别后，激活下游的NF-κB。通常情况下NF-κB的两个亚基与IκB组成三聚体广泛存在于细胞质中，LPS刺激后，IκB被IκB激酶(IKK)磷酸化激活，从NF-κB-IκB三聚体中释放，继而进入蛋白酶体中降解，失去了IκB的NF-κB处于磷酸化的激活状态，转移进入细胞核中，与相关细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8基因的启动子区域结合，调控其表达[15-17]。LPS引起的炎症通路蛋白的激活已在多种体外模型中得到验证[18-20]。本试验通过Western blot和免疫荧光等方法，发现LPS刺激后，BHEC内TLR4、p-IκB和p-P65的蛋白水平显著升高，核内P65水平显著上升，证明TLR4-NF-κB炎症信号通路被激活。IL-1β、IL-6、IL-8是重要的炎性介质，参与机体免疫系统调节，其中，IL-8在炎症早期产生，对炎症的发生发展具有重要指征作用[21]。LPS可以通过激活NF-κB来提高BHEC中IL-1β、IL-6、IL-8等细胞因子的表达[19]。此外，LPS还可以引起NF-κB的入核，继而引起奶牛乳腺上皮细胞炎症及氧化应激[22]。本试验对BHEC添加LPS刺激后，IL-1β、IL-6、IL-8等炎性因子的mRNA表达显著升高，说明炎症细胞模型构建成功，炎症相关信号通路被激活，与上述结果基本一致。

牛磺酸，又名2-氨基乙磺酸，是机体内富含的一种含硫β氨基酸，广泛存在于动物组织中[23]。有研究表明，牛磺酸在抗氧化及抗炎方面效果显著[24-26]。由三氧化物引起的骨骼肌活性氧增多在补充牛磺酸后得到改善[27]。牛磺酸对炎症的治疗作用可以通过抑制NF-κB的激活来实现[28]。通过添加不同剂量的牛磺酸，可以显著降低由LPS引起的小鼠乳腺上皮细胞TNF-α、IL-1β、IL-6的表达[11]。同时，牛磺酸可以抑制由大肠杆菌引起的奶牛乳腺上皮细胞TLR4-NF-κB信号通路激活，继而抑制下游一系列细胞因子表达[29]。本研究通过对细胞预处理牛磺酸进行保护，显著降低了LPS引起的IL-1β、IL-6、IL-8、P65、TLR4 mRNA表达，抑制了p-P65、p-IκB、TLR4的蛋白表达以及核内P65水平，证明牛磺酸通过抑制TLR4-NF-κB信号通路的激活，抑制了LPS引起的BHEC炎症反应。

综上所述，本试验成功构建了牛磺酸保护LPS引起的BHEC炎症反应体外模型，证明了牛磺酸对LPS诱导BHEC炎症的保护作用及其相关信号通路的调控作用，为临床上通过在饲料中添加牛磺酸治疗奶牛肝脏炎症提供了一定的理论依据。