桑椹多糖的提取工艺优化及含量研究

董强，白静，岳攀，李阳，国锦琳▲

(1.成都中医药大学 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137；2.成都中医药大学 医学技术学院，四川 成都 611137)

桑椹(Mori Fructus)为传统的药食同源中药，中国药典规定其来源为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥果穗，具有滋阴补血，生津润燥的功效[1]，国内外研究证实桑椹多糖是其主要活性成分，具有抗氧化、降血糖、保肝、抗肿瘤、调节免疫等药理活性[2-5]。据文献报道[6]桑椹主要产地有四川省攀枝花市(盐边)、山东省德州市(夏津)、新疆维吾尔族自治区吐鲁番市、河北省沧州市(泊头)等，本研究的样品采集自桑椹主要产地，通过单因素试验及响应曲面法优化提取桑椹多糖的工艺，以优化后的工艺提取，并测定不同批次桑椹的多糖含量。

1 材料

1.1 材料与试剂

葡萄糖(质量分数≥98%，成都普菲德生物技术有限公司，批号：17042603)；苯酚(分析纯，成都市科隆化学品有限公司，批号：2019012301)；浓硫酸(分析纯，西陇科学股份有限公司，批号：191213)。其他试剂均为分析纯。

供试桑椹样品共13个批次，分别采自安徽，新疆，河北，山东，北京，四川，具体信息见表1。经成都中医药大学国锦琳教授鉴定为桑科桑属植物桑的果穗桑椹(Mori Fructus)。所有药材样品均经产地加工后留样保存在成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室。

表1 桑椹样品信息

1.2 仪器与设备

紫外-可见分光度计(SP-756P型，上海光谱仪器有限公司)，隔膜真空泵(GM-1.0A,天津市津腾实验设备有限公司)，超声波清洗器(SB-120DT，宁波新芝生物科技股份有限公司)，电子天平(ML304T，精度0.1 mg，德国梅特勒-托利多公司)，高速冷冻离心机(3-18KS型，美国Sigma公司)，冷冻干燥机(Alpha 1-4 LSCplus，德国Alpha公司)。

2 方法

2.1 样品制备

桑椹皆在冷冻干燥机中冻干24 h，各批次样品含水率水平控制一致。冻干后粉碎，精密称取1.000 g置50 mL离心管中，按照一定料液比加入超纯水，在一定的温度下超声提取一定的时间，离心分离上清，残渣以相同条件提取、离心一次，合并上清，将乙醇加入上清中至乙醇体积分数80%，4℃放置12 h，离心后弃上清，残留物即为桑椹多糖[7]。

2.2 多糖含量测定

采用苯酚硫酸法[8]测定多糖含量。精确称取105℃干燥恒重后的葡萄糖标准样品4.0 mg，加水溶解并定容至100 mL，制得浓度为40 μg/mL的葡萄糖标准溶液。准确吸取葡萄糖标准溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分别置于试管中，加水定容至1.0 mL后加入6%苯酚溶液1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，静置10 min，摇匀，室温放置30 min后于490 nm处测定吸光值。以葡萄糖浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线，样品的多糖含量以葡萄糖当量表示，记为每克桑椹干重含葡萄糖毫克数，多糖得率记为每克桑椹干重含葡萄糖克数。

2.3 单因素试验

精密称取桑椹样品粉末1.000 g置于50 mL离心管，参考文献[9-11]的方法，按照表2分别对温度、料液比及超声时间进行单因素实验，考察各因素对多糖得率的影响。做3次重复试验。

表2 桑椹多糖得率单因素设计

2.4 响应面法优化桑椹多糖提取工艺

采用响应曲面法对桑椹多糖的提取工艺进行优化。利用design-expert 10.0软件在单因素试验的基础上，以料液比、超声时间、温度，进行三因素三水平的Box-Behnken中心组合试验设计，以桑椹多糖提取得率为响应值，采用响应曲面法(RSM)分析3个因素对响应值的影响。考察条件如下表3。

表3 Box-Behnken试验因素水平及编码

2.5 桑椹多糖含量测定

采用优化后的工艺提取6个产地的13批桑椹样品，并以“2.2”项下方法测定各批提取物的多糖含量。采用SPSS 22.0软件对6个产地的桑椹多糖含量进行方差分析，比较不同产地桑椹的多糖含量是否有差异。

3 结果

3.1 单因素分析

3.1.1 提取温度对桑椹多糖得率的影响

35℃～80℃范围内，温度小于65℃时得率随温度升高而增加，温度为65℃时得率达到最大值，温度继续增大得率略有减小(见图1)。

图1 温度对桑椹多糖得率的影响

3.1.2 料液比对桑椹多糖得率的影响

料液比1∶10 g/mL至1∶25 g/mL范围内，比例增大桑椹多糖得率增加，料液比为1∶15 g/mL时得率达到最大值，继续增大得率略有减小(见图2)。

图2 料液比对桑椹多糖得率的影响

3.1.3 超声时间对桑椹多糖得率的影响

超声提取时间对桑椹多糖得率的影响见图3。超声时间为20 min时，桑椹多糖的得率最高。

图3 超声时间对桑椹多糖得率的影响

3.2 响应曲面实验优化结果

通过响应曲面法对料液比、超声时间、提取温度3个因素进行实验设计，得到实验方案及结果见表4。

表4 响应面分析设计及结果

3个因素对桑椹多糖提取得率的影响经design-expert 10.0软件分析，回归拟合后得二次多项回归模型:Y=12.39+0.66A-0.32B+1.63C+0.9AB+0.92AC-0.72BC-1.27A2-2.02B2-4.36C2，式中，Y代表多糖得率，A、B、C分别代表温度、时间、料液比。方差分析见表5。由表5可知，模型的P<0.01，失拟项检验的P>0.05，R2=0.916 0表明模型拟合程度较高，CV为15.77%，表明试验精确度良好，可用该模型对桑椹多糖提取进行分析和预测。由回归模型显著性分析可知3个因素的主次顺序为：料液比>温度>时间。两两因素对桑椹多糖得率的交互作用响应面图，见图4。

图4 两因素交互作用对多糖得率响应面图

表5 回归模型方差分析

通过软件分析，提取桑椹多糖的最佳条件为：温度为69.88℃、时间为22.14 min、料液比为1∶16.13 g/mL ，在此条件下多糖得率可达12.69%。为验证实验结果的可靠性，采用优化工艺条件做验证试验，为便于实际操作将条件调整为：温度为70℃、时间为22 min、料液比为1∶16 g/mL，在此条件下多糖得率可达12.45%。结果与模型预测结果一致，建立的最优工艺参数可靠。

3.3 多糖含量测定

葡萄糖标准曲线的回归方程为Y=7.785X+0.1734，R2=0.999 1，在0.03～0.20 mg/mL线性良好。根据公式计算出提取物中多糖含量(以葡萄糖当量计)，结果见表6。

表6 桑椹多糖提取物的多糖含量

对6个产地的桑椹多糖含量进行方差分析，分析结果见表7。产地间无显著性差异(P>0.05)。

表7 6个产地桑椹多糖含量方差分析

4 讨论

超声法是利用超声波产生的强烈振动、强烈空化效应、热效应、搅拌作用等加速药物成分进入溶剂，从而提高提取效率的方法[9]。有研究表明高温、超声等因素对多糖结构有一定的破坏作用[12-13]，本实验中随着超声时间延长、水浴温度升高，桑椹多糖得率有所下降，可能是超声、高温导致多糖结构被破坏而损失。本研究采用控温超声提取的方式，综合了加热和超声提取的方式，相比已报道的浸提法[11]用时更少。本研究测定了6个产地13个批次的桑椹样品，未发现多糖含量与产地的相关性。据杨文宇[14]考证，由于桑椹易于杂交，其栽培品种有上千余个。据陈杭君[15]研究桑椹多糖含量与桑椹栽培种、成熟度有显著相关。本研究中不同批次桑椹多糖差异可由栽培品种、栽培技术等差异导致，产地不是影响桑椹多糖含量的主要因素。