结核感染T细胞斑点试验与抗结核抗体试验对结核病的诊断价值

吴天恩，乐永宏，杨小燕

赣州市人民医院检验科 (江西赣州 341000)

结核病属于慢性传染性疾病，主要病原菌是结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)。当MTB侵入机体后，会对肺及淋巴系统造成破坏，进一步累及循环、泌尿及骨骼等系统，严重危害患者的身体健康，因此，对结核病进行早期诊断、及时治疗十分重要[1]。但是，由于结核病患者的临床症状不明显，易导致误诊。结核感染T细胞斑点试验(tuberculosis infection of T cells spot test，T-SPOT.TB)是以细胞免疫应答为基础的干扰素-γ(interferon-γ，INF-γ)试验，试验中的抗原均来自MTB基因组与卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)缺失区域，即差异的区域(region of difference，RD)，有效避免了与BCG接种引起的交叉反应，降低了假阳性率。抗结核抗体试验是以患者感染MTB后体液免疫应答为基础，通过MTB抗原特异性的抗体来判定结核病[2-3]。上述两种方式均为现阶段临床诊断结核病的有效方法。基于此，本研究比较T-SPOT.TB与抗结核抗体试验对结核病的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2014年6月至2020年12月我院收治的94例高度疑似结核病患者的临床资料，其中男61例，女33例；年龄21～49岁，平均(34.97±4.65)岁。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。纳入标准：存在咳血、盗汗、咳嗽、胸痛等结核病临床特征；临床资料完整。排除标准：在进行T-SPOT.TB与抗结核抗体试验检查前已经过痰培养确诊为阳性；伴有免疫系统疾病；既往接受过抗结核病治疗。

1.2 方法

1.2.1T-SPOT.TB试验

(1)样本采集：采集患者外周肘静脉血4 ml于肝素钠抗凝真空管中(于4 h内送检)，然后将RPMI-1640培养液加入抗凝管中与所采集血液充分混合后，加入4 ml淋巴细胞分离液，以3 200 r/min离心20 min，离心后可见单个细胞存在于抗凝管中间的云雾状层中；将分离出的单个细胞层置于15 ml的离心管中，用RPMI-1640培养液补齐至10 ml，以3 200 r/min离心7 min，弃去上清液，用RPMI-1640培养液补齐至10 ml，轻轻吹打沉淀后，以3 200 r/min再次离心7 min；弃去上清液，加入500 μl AIM-V无血清培养液；随后加入40 μl 0.4%台盼蓝染液和10 μl细胞悬液，将混合细胞液进行活细胞计数处理；用无血清培养基配置浓度为2.5×106个/ml的细胞悬液至少400 μl。(2)培养板设置：将50 μl AIM-V无血清培养液、50 μl抗原A(B)加入培养板中，同时设立阳性对照50 μl，每孔加入浓度为2.5×106个/ml的细胞悬液100 μl，放于5% CO2培养箱孵育16～20 h，温度保持在37 ℃左右。(3)斑点计数：在培养板孔内加入50 μl酶标抗体溶液孵育1 h，洗板5次，随后加入50 μl底物溶液，在室温下反应7 min，然后用蒸馏水洗涤行干燥处理，最后采用德国AID牌ELISPOT计数仪行斑点统计。(4)结果判定：阴性，抗原A(B)斑点数较阴性对照斑点数>6个，且阴性对照斑点数<5个，反之则为阳性。

1.2.2抗结核抗体试验

检测试剂盒由西安联尔科技有限公司提供，采用蛋白芯片法检测患者38 kD菌蛋白IgG，采集患者外周肘静脉血3 ml于分离胶促凝管中，以3 200 r/min离心5 min，取血清待检，取出芯片编码后，在反应区加入试剂盒内A液200 μl，完全浸润反应膜表面，待完全渗透后，于室温下静置1 min，加入100 μl待测血清，待血清完全渗透后，加入试剂盒内B液300 μl，完全渗透后，加入试剂盒内D液300 μl，完全渗透后，待反应膜表面干燥，在30 min内使用生物芯片识别仪进行判读。临界值=阴性对照OD均值+0.15；样本OD值S/CO≥1为阳性，否则为阴性。

1.3 观察指标

以痰培养结果为金标准，比较T-SPOT.TB与抗结核抗体试验诊断结核病的效能。

1.4 统计学处理

采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析。计数资料以率表示，采用χ2检验；一致性评价采用Kappa检验，Kappa>0.74提示一致性好，0.40～0.74提示一致性一般，<0.40提示一致性差。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 痰培养结果

94例高度疑似结核病患者，经痰培养确诊64例，其中肺结核22例，肺外结核42例。

2.2 T-SPOT.TB与抗结核抗体试验诊断结核病的效能比较

经T-SPOT.TB检出阳性62例，阴性32例，与金标准检验结果的一致性好(Kappa=0.759)，见表1；经抗结核抗体试验检出阳性55例，阴性39例，与金标准检验结果的一致性一般(Kappa=0.524)，见表2；T-SPOT.TB诊断结核病的灵敏度、准确度均高于抗结核抗体试验，差异有统计学意义(P<0.05)；两种诊断方法的特异度比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表1 T-SPOT.TB的诊断结果(例)

表2 抗结核抗体试验的诊断结果(例)

表3 T-SPOT.TB与抗结核抗体试验诊断结核病的效能比较(%)

3 讨论

阻断MTB的传播是控制结核病的关键。痰培养是临床诊断结核病的金标准，但耗时较长，易延误诊断，导致MTB发生传染、扩散[4-5]。有研究发现，免疫反应在结核病的发生、发展中起到重要的作用，而相应的诊断技术T-SPOT.TB与抗结核抗体试验在结核病早期检查中也逐渐得以开展[6]。机体在感染MTB后会刺激T细胞活化，T-SPOT.TB可在酶联免疫法检测的基础上，对患者活化特异性T细胞进行检测，进而减少卡介苗接种、其他分枝杆菌导致的假阳性，有助于对高度疑似结核病患者及潜伏性结核感染患者进行筛查。抗结核抗体试验则以检测38 kD菌蛋白IgG为原理，这是由于38 kD蛋白抗原属于脂蛋白，可刺激B细胞产生抗体[7]。

本研究结果显示，T-SPOT.TB与金标准检验结果的一致性好，抗结核抗体试验与金标准检验结果的一致性一般；T-SPOT.TB诊断结核病的灵敏度、准确度均高于抗结核抗体试验；表明T-SPOT.TB在结核病诊断中的应用价值较高，与以往研究结果相似[8]。经分析，其原因可能与T-SPOT.TB采用斑点计数有关，而斑点计数越多越有助于区分结核活动度，同时提示结核活动度越大。在结核病患者的不同阶段，自身细胞及体液免疫会出现失衡，此时若考虑进行T-SPOT.TB与抗结核抗体试验联合检测，则可从不同角度体现结核病的诊断效果，可能利于提高诊断准确度，但还需相关研究加以佐证。

综上所述，T-SPOT.TB诊断结核病的灵敏度、准确度均高于抗结核抗体试验，临床应用价值较高。