α-乳白蛋白源ACE抑制肽快速筛选及验证

侯成杰，聂彩清，王彦茜，艾连中，夏永军，张 汇，谢 凡，王光强

（上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093）

高血压是一种引起广泛关注的心血管疾病，是诱发脑梗死、心肌梗死、肾衰竭等疾病的危险因素。血管紧张素转化酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）可以催化血管紧张素-I转变为具有血管收缩功能的血管紧张素-II，从而引起血压升高。因此，通过抑制ACE活性能够有效降低血压[1]。目前广泛使用的卡托普利、来诺普利、依那普利等降压药物均是通过抑制ACE活性在临床上实现降血压的作用。但是这些化学合成类药物也会带来一系列副作用，如诱发咳嗽、皮疹等[2]。后来研究人员发现天然食物中也具有可以抑制ACE活性的物质，特别是在蛋白质水解得到的活性肽中发现了大量具有ACE抑制活性的ACE抑制肽，目前研究人员已经在乳酪蛋白[3]、乳清蛋白[4]、鸡蛋蛋白[5]、鱼鳞蛋白[6]、牡蛎蛋白[7]、大豆蛋白[8]、高粱蛋白[9]、花生蛋白[10]、燕麦麸蛋白[11]等多种蛋白中水解分离得到了几千种ACE抑制肽。与人工合成的药物相比，食源性ACE抑制肽无副作用、更安全，并且种类多、易制备。因此，食源性多肽被认为是治疗高血压的一种更健康、更自然的替代来源。

蛋白质分子中的多肽序列本身并不具有生物活性，因而通常采用酶催化水解的方式将多肽水解为寡肽以便获得生物活性肽。在ACE抑制肽的研究中，传统研究方法一般是先采用单一酶或复合酶水解目标蛋白得到酶解液，再通过超滤、分子排阻色谱、高效液相色谱等方式分离鉴定出各种ACE抑制肽[12-13]。传统方法虽然是一种制备并鉴定ACE抑制肽的有效方法，但是也存在筛选盲目、耗时长、分离效率低、成本高等缺点。随着计算机技术和生物信息学的发展，人们越来越希望建立一种利用计算机快速筛选ACE抑制肽的新方法。虚拟酶解是在已知各种酶的酶切位点和目标蛋白质氨基酸序列的基础上，采用计算机辅助方式模拟蛋白酶对蛋白质肽键的水解，进而分析得到蛋白质水解后的各种小肽等产物。分子对接则可以通过模拟受体与配体的对接快速筛选出具有ACE抑制作用的活性肽，并对活性肽与ACE的作用机理进行解析。相对于传统酶解后分离鉴定的方式，虚拟酶解和分子对接方法可以极大提高活性肽的筛选效率[13]。

采用酶解蛋白制备功能肽的关键是选择合适的蛋白酶，不同蛋白酶具有不同的酶切位点，目前常用的酶有碱性蛋白酶（EC 3.4.21.62）、胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）、木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.2）、蛋白酶K（EC 3.4.21.64）、胰凝乳蛋白酶（EC 3.4.21.1）、胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）等[12]。碱性蛋白酶（EC 3.4.21.62）是一种丝氨酸胞内蛋白酶，能够对Phe、Leu、Trp和Tyr链接肽键的C末端进行酶切，其酶解产物的C末端通常带有疏水性氨基酸[14]，而这种结构正是很多ACE抑制肽的结构特点。胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）是脊椎动物的一种消化酶，属于一种内切酶，其特异性酶切位点主要是碱性氨基酸，可以在C端产生带正电的氨基酸肽段，这些特点也符合ACE抑制肽的特点[15]。采用两种或多种酶复合酶解的方式可以更充分地酶解肽段，得到更多更小的肽段，而相较于长肽，短肽具有更高的ACE抑制活性和更好的肠道吸收特性[16]。因此，本研究采用碱性蛋白酶（EC 3.4.21.62）和胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）同时进行酶解的方式，以期得到更多具有ACE抑制活性的短肽。

本研究以α-乳白蛋白为目标蛋白，通过生物信息学手段快速筛选出一种新的ACE抑制肽。首先采用虚拟酶解的方法获得大量寡肽及其序列，再使用在线预测软件对这些寡肽的生物活性、毒性和物理化学性质进行预测，然后通过模拟分子对接的方式筛选出能与ACE结合的活性肽，最后通过固相法合成活性肽进行体外活性验证，并通过全柔性分子对接模拟研究ACE抑制肽与ACE的作用机理。旨在为筛选ACE抑制肽提供一种简便、快速、高效、低成本的方法，为食源性ACE抑制肽的快速筛选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

ACE、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（4-hydroxyethylpiperazine ethylsulfonic acid，HEPES） 美国Sigma-Aldrich公司；马尿酰-组氨酸-亮氨酸（hippuryl-histidyl-leucine，HHL）、马尿酸 上海源叶生物科技有限公司；乙腈、三氟乙酸（均为色谱纯） 上海安谱实验科技股份有限公司；盐酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；氯化钠（分析纯） 上海泰坦科技股份有限公司；固相法合成三肽Pro-Glu-Trp（PEW）（纯度≥98%） 上海淘普生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

e2965高效液相色谱仪 美国Waters公司；DK-8AD电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；ML204电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Discovery Studio 2016 R2 Client 美国Accelrys公司。

1.3 方法

1.3.1 获得α-乳白蛋白的氨基酸序列

α-乳白蛋白的氨基酸序列来源于Universal Protein（https://www.uniprot.org/），α-乳白蛋白的编号为P00711，氨基酸数目为142。

1.3.2 虚拟酶解

通过BIOPEP-UWM（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）[17]中的“enzyme action”程序对已知氨基酸序列的α-乳白蛋白进行虚拟水解，使用的蛋白酶为胰蛋白酶（EC3.4.21.4）和碱性蛋白酶（EC3.4.21.62）。

1.3.3 ACE抑制肽的筛选

将虚拟酶解α-乳白蛋白获得的所有的肽与在线数据库BIOPEP-UWM和AHTPDB（http://crdd.osdd.net/raghava/ahtpdb/）[18]中已被报道的ACE抑制肽进行比对，筛选出未被报道的肽进行下一步研究。

将所有未被报道的新型肽在PeptideRanker（http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/Server_pages/peptideranker.php）预测网站中进行潜在生物活性评分，输入每一个肽的氨基酸序列后，都会有对应的生物活性评分，评分越高，代表肽的生物活性越大，通常生物活性评分不小于0.5，即可被认为是活性肽。本实验选择生物活性评分不小于0.5的肽作为实验对象。

1.3.4 生物活性及物理化学性质预测

使用在线网站Innovagen（http://www.innovagen.com）分析肽在水中的溶解度，这是一个基于肽的等电点、带电残基数量和肽长度进行的评估，网站会将肽段水溶性分为“Good water solubility”和“Poor water solubility”2种，本研究通过该程序预测水溶性良好的活性肽。

使用在线网站ToxinPred（http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/）[19]预测肽的毒性。

使用在线软件Expasy-compute的pI/Mw tool（http://web.expasy.org/compute_pi/）[20]预测肽的分子质量（molecular weight）和等电点（pI）。

使用在线网站Pepdraw（http://www.tulane.edu/～biochem/WW/PepDraw）预测肽的净电荷和疏水性。

1.3.5 半柔性分子对接筛选ACE抑制肽

准备受体：从蛋白质数据库（http://www.rcsb.org）下载ACE的天然晶体结构（PDB代码：1O8A）。使用Discovery Studio 2016 Client软件打开PDB文件，删除其3D晶体结构中的水分子和杂原子，保留Zn2＋和Cl－，并通过Macromolecules模块中的“Clean Protein”优化蛋白质结构，去除蛋白多构象，为ACE补全氢原子和完整的氨基酸残基。以Zn原子为活性中心，定义活性坐标（X：38.977；Y：38.645；Z：50.183），对接半径为10 Å。

准备配体：使用Discovery Studio 2016 Client软件构建寡肽化合物，分别使用“Prepare Ligands”和“Full Minimization”定义寡肽为配体并进行结构优化。

半柔性分子对接：使用Discovery Studio 2016 Client软件中的“CDOCKER”模块，将受体定义为刚性，配体定义为柔性，进行半柔性分子对接，以“－CDOCKER Energey”值和“－CDOCKER Interaction Energy”值作为评分指标。

1.3.6 三肽PEW的合成

采用9-芴甲氧羰基（9-fluorenylmethyloxycarbonyl，FMOC）固相合成法制备三肽PEW，以二氯树脂为载体，将首个带有FMOC保护氨基酸的羧基连接在树脂上，然后用哌啶脱去FMOC保护基，再加入第2个保护氨基酸并加入缩合剂进行缩合反应，重复上述步骤完成三肽的合成。三肽PEW的合成委托上海淘普生物科技有限公司完成。

1.3.7 三肽PEW的ACE抑制活性测定[21]

采用高效液相色谱法测定三肽PEW的ACE抑制率：将三肽PEW溶于50 mmol/L HEPES缓冲液（含300 mmol/L氯化钠）得到不同浓度的PEW溶液（0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L），取PEW溶液50 μL与100 μL 5 mmol/L HHL混合，37 ℃水浴预热30 min，然后加入30 μL ACE溶液（0.1 U/mL），37 ℃水浴反应30 min，加入100 μL 1 mol/L盐酸终止反应，经0.22 μm滤膜过滤后测定。Waters e2695高效液相色谱仪，色谱柱：XBridge C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；色谱条件：0.05%三氟乙酸溶液和乙腈的体积比75∶25；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；紫外检测器，检测波长228 nm。

马尿酸标准曲线：配制5.0 mmol/L马尿酸溶液，并依次稀释至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mmol/L，色谱条件同上，以马尿酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

ACE抑制率计算公式如下：

式中：A为以HEPES缓冲液为对照反应得到马尿酸的生成量/（mmol/L）；B为加入三肽PEW反应所得马尿酸的生成量/（mmol/L）。

IC50值为ACE抑制率为50%时活性肽的浓度。

1.3.8 ACE抑制模式的测定

将不同浓度的HHL（1、2、3、4、5 mmol/L）和PEW（0、2、4 mmol/L）与ACE混合，37 ℃水浴反应30 min，按照1.3.7节方法测定马尿酸的生成量，计算反应速度。然后以HHL浓度和反应速度双倒数作Lineweaver-Burk图分析酶抑制动力学。

1.3.9 全柔性分子对接

受体及配体的准备同1.3.5节。使用Discovery Studio 2016 Client软件中的Flexible Docking模块将配体对接到受体中，将ACE定义为受体，寡肽定义为配体。根据相关的文献报道以及PDB蛋白数据库中ACE-赖诺普利复合物（1O86.pdb）、ACE-依那普利复合物（1UZE.pdb）和ACE-卡托普利复合物（1UZF.pdb）的X射线晶体衍射三维结构，可以了解ACE与ACE抑制肽的结合位点的大致区域，明确活性口袋包括19 个氨基酸残基（His353、Ala354、Ser355、Ala356、His383、Glu384、His387、Phe391、Pro407、His410、Glu411、Phe512、His513、Ser516、Ser517、Val518、Pro519、Arg522、Tyr523）[22]，对接半径8 Å。具体对接参数见表1。

表1 分子柔性对接实验参数Table 1 Parameters for flexible molecular docking

1.4 数据统计

采用Graphpad Prism 8.0.2进行作图和数据分析，所有实验过程重复不少于3 次。

2 结果与分析

2.1 α-乳白蛋白的虚拟酶解及ACE抑制肽的筛选

α-乳白蛋白经胰蛋白酶和碱性蛋白酶虚拟酶解后，共得到38 个寡肽，其中包含了2 个重复序列，no.10和no.16均为GY，水解位点分别为36～37和54～55。将所有的寡肽与BIOPEP-UWM和AHTPDB数据库中已报道的活性肽序列进行比对，共发现了14种已报道的活性肽，其中有8种活性肽具有ACE抑制活性，具体结果见表2。

表2 虚拟酶解得到的肽Table 2 Peptides obtained by virtual enzymatic hydrolysis

为继续从未报道的寡肽中筛选潜在的ACE抑制肽，通过在线分析软件对未报道的23种寡肽生物活性进行评分，从中选择出生物活性评分大于0.5的短肽，对其水溶性、等电点、相对分子质量、净电荷和疏水性等一系列理化性质进行预测，结果见表3。

表3 肽的理化性质Table 3 Physicochemical properties of the peptides

肽的理化性质与其生理活性密切相关，通常ACE抑制肽包含2～20 个氨基酸，分子质量较小，根据构效关系的研究表明，分子质量较低的肽更适合与ACE进行结合，通常具备更高的ACE抑制活性[1]。表2列出的8种已报道ACE抑制肽均为二肽，最大相对分子质量为317.37，本研究筛选出的4 个活性肽为PEW、DQW、MMS和CS，其氨基酸个数均小于4，相对分子质量均小于500。疏水性指的是肽从水相环境向疏水环境转变的自由能，使用Wimley-White标度，这是一个实验测定性质的标度，其中肽的疏水性是Wimley-White疏水性的总和[23]。丁龙[24]研究发现寡肽吸收率与疏水性和分子质量均具有显著相关性。肽的整体疏水性对其ACE抑制活性也很重要，亲水性肽通常只有弱的或没有抑制活性，这是因为ACE的活性中心为疏水性，亲水性分子难以与活性中心结合[22-25]。由表3水溶性结果可知，PEW、DQW和CS的水溶性良好，证明它们在水溶液中较稳定，适合在实验室进行制备，也易于被肠道快速吸收。构效关系研究表明，当ACE抑制肽C末端倒数3 个氨基酸残基中含有色氨酸（W）、酪氨酸（Y）、苯丙氨酸（F）和脯氨酸（P）时，抑制肽具有较高的ACE抑制活性[26]。综上所述，初步推测PEW和DQW可能具有ACE抑制活性。

2.2 基于分子对接筛选ACE抑制肽

为进一步筛选出具有ACE抑制活性的肽，使用Discovery Studio 2016 Client软件中的CDOCKER模块进行ACE与上述4 个寡肽（PEW、DQW、MMS、CS）的半柔性对接，通过模拟分子对接的结果评价其与ACE的结合能力。在分子对接中，打分函数通常被用于评价受体与配体的不同构象之间的相互结合程度和亲和程度，进而选择最优的构象组合进行更进一步分析研究，因此打分函数对于分子对接结果好坏起关键性作用。目前主要有3种常用的打分函数：基于力场、基于经验和基于知识的评价函数[27]，常见的有CDOCKER、Libdock、LigandFit、GOLD和ZDOCK等，不同评价函数都有其各自使用的针对性和特殊性。CDOCKER是一种精准的分子对接技术，兼具有对接精度高和对接时间较短的优点，被广泛应用于从小分子数据库中搜寻与受体大分子具有高亲和力的小分子。“－CDOCKER Interaction Energy”值是受体与配体相互作用力的评分，“－CDOCKER Energy”值是“－CDOCKER Interaction Energy”与分子内能的和，“－CDOCKER Energy”值相对越高，表示其结合越紧密[5]。将2.1节得到的4 个寡肽和8 个已报道的ACE抑制肽分别与ACE进行CDOCKER半柔性对接，对接结果见表4。

表4 活性肽与ACE的半柔性对接评分Table 4 CDOCKER Energy values of the peptides

由表4可以看出，ACE-PEW复合物的“－CDOCKER Energy”和“－CDOCKER Interaction Energy”值分别为72.480 3 kcal/mol和73.491 5 kcal/mol，与其他已报道的ACE抑制肽评分相近，推测PEW与ACE具有较好的结合作用，而其他3 个肽无法与ACE实现半柔性对接，说明其他3 个肽与ACE的结合效果不佳。通过与AHTPDB数据库比对发现来源于乳清蛋白的ACE抑制肽KGYGGVSLPEW（IC50=0.7 μmol/L）[28]，这个肽段包括了肽PEW。肽的氨基酸序列是其生物活性的决定因素，研究表明某些具有相同氨基酸序列的肽也会具有相似的生物活性[29]。因此初步筛选出PEW是潜在具有ACE抑制作用的活性肽，下一步将对PEW的ACE体外抑制活性进行实验验证。

2.3 三肽PEW的ACE抑制活性

采用FMOC固相化学合成法合成三肽PEW，并采用高效液相色谱法对其ACE抑制率进行测定，结果见图1。PEW抑制率方程为y=－0.013 3x²＋0.173 3x＋0.068 3，R2=0.963 6，根据抑制率方程求得IC50为3 130 μmol/L，证实了PEW具有ACE抑制活性。IC50值表示ACE抑制率达到50%时的肽浓度，IC50值越低说明肽的抑制效果越好。表5列出了几种已报道ACE抑制肽的IC50值，其中最小的IW为4.7 μmol/L，最大的GG为7 200 μmol/L，而PEW的IC50值（3 130 μmol/L）相对较高，说明其ACE抑制活性要差于VF、GY、IW、VK、GL、IL 6种肽，但优于二肽GG。构效关系研究指出，当C末端残基为谷氨酸（E）时，会降低肽的ACE抑制活性[30]，这可能是PEW比其他6种二肽抑制活性低的原因。

图1 PEW的ACE抑制活性Fig.1 ACE-inhibitory activity of PEW

表5 ACE抑制肽的IC50值Table 5 IC50 of ACE inhibitory peptides

2.4 三肽PEW对ACE的抑制模式分析

为了评估三肽PEW的活性机制，通过Lineweaver-Burk图分析了其对ACE的抑制作用。如图2所示，三肽PEW表现出竞争性抑制作用，随着肽浓度的增加，Vm值固定不变，Km值增大。竞争性抑制模式说明三肽PEW与天然底物在结构上相似，可以结合在ACE的活性位点，阻止ACE与底物的结合，降低了ACE与底物的亲和力。

图2 三肽PEW对ACE的抑制Lineweaver-Burk图Fig.2 Lineweaver-Burk plot of ACE inhibition by PEW

2.5 ACE与三肽PEW的作用机理

为了进一步阐明PEW与ACE的相互作用机制。采用Discovery Studio 2016 Client软件模拟PEW与ACE的分子全柔性对接并进行进一步的分析，对接结果如图3所示。柔性分子对接结果显示，ACE-PEW复合物的“－CDOCKER Energy”值和“－CDOCKER Interaction Energy”值分别增加为85.811 2 kcal/mol和93.971 1 kcal/mol。说明柔性对接情况较半柔性对接分子间的结合更紧密，更能反映分子结合的状态。由图3可以看出，PEW结合于ACE分子的空腔处，PEW与ACE共形成了6 个氢键，包括与3 个氨基酸残基（His383、Glu384、His387）相互作用形成的3 个不同距离的碳氢键，与氨基酸残基Ala354形成的3 个普通氢键。

图3 肽PEW与ACE的分子对接相互作用Fig.3 Molecule docking simulation between peptides PEW and ACE

表6列出了ACE-PEW复合物在最佳构象时的相互作用力，PEW与氨基酸残基Ala354形成的3 个氢键中PEW的H41和Ala354的O之间形成的氢键最短，结合最紧密，说明氨基酸残基Ala354在与PEW相互结合的过程中起到了关键性作用。

表6 ACE-PEW复合物最佳构象时相互作用力Table 6 Interaction forces in ACE-PEW complex with optimal conformation

PEW还与ACE的Trp357形成了Pi-Pi键，属于疏水性相互作用，与ACE的Lys368、Glu384、Zn701分别产生了3 个静电相互作用，此外Glu384同时与PEW存在盐桥相互作用。Ala354、Glu384是活性口袋S1中主要的氨基酸残基。研究显示多种ACE抑制肽都可以与这2 个氨基酸残基形成相互作用，如七肽SSYYPFK[37]、三肽HGR[38]均可以与Glu384形成氢键，三肽KDF[38]、VDF和EGF[39]则可以分别与Glu384形成静电力、Pi键和盐桥；EWL、KDF[38]、WQR、EGF、LEW[39]可以与Ala354形成氢键。ACE是一种Zn2＋四面体依赖型的酶，因此Zn701也是ACE的一个重要的活性位点，研究表明八肽GHVGAAGS[40]和三肽EWL、KDF[38]、WAR、HGR、VDF[39]均可以与Zn701形成相互作用。通过热力学原理可得，小分子配体与大分子受体之间结合程度的强弱往往取决于对接过程中自由能发生的变化，所以受体蛋白和配体分子之间的相互作用力对于该复合物的亲和程度和结合模式有很大影响，例如氢键、静电相互作用和疏水相互作用往往是有助于复合物结合的相互作用力，因此ACE-PEW中这3种作用力都有助于结构稳定。ACE主要含有3 个活性口袋：S1（Ala354、Glu384、Tyr523）、S2（Gln281、His353、Lys511、His513、Tyr520）和S1’（Glu162），这3 个口袋分别是ACE重要的催化活性位点[12]。大量研究都表明氢键是维持ACE与抑制肽结合的主要作用力[41]，PEW与S1口袋的Ala 354、Glu384形成了4 个氢键，说明PEW能与S1口袋形成紧密的结合。Wu Qiongying等[42]发现配体与ACE残基His383、His387和Glu411之间的相互作用可能导致四面体配位的Zn2＋的扭曲，从而造成ACE催化活性的失活。在本研究中，PEW与His354、Glu384同样产生了强相互作用，这可能是ACE活性受到抑制的重要因素。Yu Zhipeng等[38]在研究中将用于临床的降压药赖诺普利与ACE进行了分子对接，结果显示赖诺普利可以与Ala354、Glu384、His383、Zn701形成相互作用，这与PEW-ACE的分子模拟结果类似，说明PEW可能与赖诺普利具有类似的抑制机制。而PEW与活性口袋S2中的His353形成了4 个不利的斥力，这表明PEW无法与S2口袋进行结合，同时还会阻碍其与其他活性位点的结合，这很可能是PEW的IC50值较高的原因。

3 结 论

本研究以α-乳白蛋白为目标蛋白，采用虚拟酶解和活性预测的方式快速筛选出具有潜在ACE抑制活性的肽，然后采用半柔性分子对接的方式将目标肽与ACE进行了模拟分子对接，筛选出了具有ACE抑制潜力的三肽PEW，并对PEW的体外抑制活性进行验证，其IC50值为3 130 μmol/L。通过全柔性分子对接探究了PEW与ACE的作用机理，全柔性对接结果显示，PEW与ACE的氨基酸His383、Glu384、His387和Ala354形成了6 个氢键，与氨基酸Trp357形成了Pi-Pi键，与Lys368、Glu384、Zn701形成3 个静电引力和1 个盐桥，氢键、疏水作用力、静电力是维持PEW与ACE结合的主要作用力，PEW与活性口袋S1的相互作用可能是其具有ACE抑制活性的主要原因。而PEW的IC50值较高可能是由于其与活性口袋S2中His353存在斥力的结果。与传统酶解后分离纯化鉴定的方法相比，本研究可以快速高效地筛选得到具有ACE抑制活性的食品蛋白源活性肽，为活性肽的快速筛选提供了新思路。