对银屑片微生物限度检查方法适用性的试验研究

黄 燕，徐丽波，袁 丽，戴余雯，刘铭佩，李待军

（1. 兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730000 ；2. 兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000 ；3. 甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000）

银屑片是兰州大学第二医院的院内制剂，由栀子、黄芪等9 味中药组成，具有泻火除烦、清热凉血等功效，主要用于牛皮癣的治疗，临床疗效显著[1]。微生物污染是影响制剂质量和引发不良反应的重要因素之一。为了保证制剂质量，必须采用适宜的方法对其进行微生物限度检查[2]。在本文中，笔者主要是分析采用文中所选微生物限度检查方法对银屑片进行微生物限度检查的适用性。

1 材料与仪器

1.1 试验样品

银屑片，100 片/ 瓶。

1.2 培养基及主要试剂

沙氏葡萄糖液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、肠道菌增菌液体培养基、RV 沙门菌增菌液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯液体培养基、pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液。上述培养基均购自青岛海博科技生物技术有限公司。

1.3 菌种

白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕、乙型副伤寒沙门菌〔CMCC(B)50094〕、大肠埃希菌〔CMCC(B)44102〕、黑曲霉菌〔CMCC(F)98003〕、 枯草芽孢杆菌〔CMCC(B)63501〕、铜绿假单胞菌〔CMCC(B)44104〕、金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕，以上菌种均购自中国食品药品检验研究院。

1.4 仪器

苏州安泰BSC-1304 ⅡA2 型生物安全柜、上海跃进SPX-80B 型生化培养箱、麦克奥迪AE2000 型显微镜、上海三申YX280A 型压力消毒器、梅特勒XSZ205 型电子天平。

2 微生物计数检查方法适用性试验

2.1 菌液制备

将各菌种均制成不同浓度的菌悬液。选用pH 7.0 无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌分别制成浓度为104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL 的菌悬液，选用0.9% 的无菌氯化钠溶液将白色念珠菌、黑曲霉菌分别制成浓度为104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL 的菌悬液[3]。

2.2 供试液制备

取银屑片10 g，加pH 7.0 无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液100 mL，制成1:10 供试液。取10 mL，加90 mL pH 7.0 无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液，制成1:100 供试液，备用。

2.3 微生物计数检查

2.3.1 试验组样品的制备 1）平皿法样品的制备：取7 份10 mL 的1:10 供试液，分别加0.1 mL 的“2.1”项下菌悬液（104 cfu/mL），摇匀，取样1 mL，倾注相应培养基。2）培养基稀释法（1:10）样品的制备：取7 份10 mL 的1:10 供试液，分别加0.1 mL 的“2.1”项下菌悬液（104 cfu/mL），分别取样0.2 mL、0.5 mL，倾注相应培养基。3）供试液稀释法（1:100）样品的制备：取5 份10 mL 的1:100 供试液，分别加0.1 mL 的“2.1”项下菌悬液（104 cfu/mL），取样1 mL，倾注相应培养基[4-5]。

2.3.2 菌液对照样品的制备 取相应量的“2.1”项下菌悬液（102cfu/mL）注皿，倾注相应培养基。

2.3.3 供试液对照样品的制备 取相应量的“2.2”项下供试液注皿，其他操作同“2.3.1”。

2.3.4 阴性对照样品的制备 取相应量的pH 7.0无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液替代供试液，注皿，不加菌悬液，其他操作同“2.3.1”。

2.3.5 用不同微生物计数检查方法对银屑片进行微生物计数检查适用性的比较 平皿法样品中铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的回收比值均低于0.5。这表明，此微生物计数检查方法不适用于对银屑片进行需氧菌总数计数检查及霉菌和酵母菌总数计数检查[6-7]。培养基稀释法（1:10，0.2 mL/ 皿）样品中白色念珠菌、黑曲霉菌的回收比值均高于0.5。这表明，此微生物计数检查方法适用于对银屑片进行霉菌和酵母菌总数计数检查。供试液稀释法（1:100，1 mL/ 皿）样品中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌的回收比值均大于0.5。这表明，此微生物计数检查方法适用于对银屑片进行需氧菌总数计数检查。详见表1。

表1 用不同微生物计数检查方法对银屑片进行微生物计数检查适用性的比较

2.4 用上述微生物计数检查方法对银屑片进行微生物计数检查适用性的验证

由表2 可知，采用供试液稀释法（1:100，1 mL/皿）和培养基稀释法（1:10，0.2 mL/ 皿）进行银屑片加菌回收试验时各种需氧菌、霉菌和酵母菌的回收比值均在0.5 ～2.0 之间。这表明，采用上述微生物计数检查方法对银屑片进行需氧菌总数计数检查及霉菌和酵母菌总数计数检查的适用性良好。

表2 银屑片加菌回收试验的结果

3 控制菌检查方法适用性试验

3.1 试验组样品的制备

取银屑片10 g，加胰酪大豆胨液体培养基100 mL、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌菌悬液各1 mL（102cfu/mL），然后进行培养、接种、观察。

3.2 阳性对照样品的制备

取大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌菌悬液各1 mL（102cfu/mL），加胰酪大豆胨液体培养基100 mL，其余操作同上。

3.3 供试液对照样品的制备

取1:10 供试液10 mL，加胰酪大豆胨液体培养基100 mL，不加菌悬液，其余操作同上。

3.4 阴性对照样品的制备

取pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10 mL，加胰酪大豆胨液体培养基100 mL，其余操作同上。

3.5 控制菌检查方法适用性验证试验的结果

由表3 可知，试验组样品和阳性对照样品中正常检出了大肠埃希菌、耐胆盐革兰氏阴性菌和沙门菌，阴性对照样品和供试液对照样品中未检出大肠埃希菌、耐胆盐革兰氏阴性菌和沙门菌。这表明，采用胰酪大豆胨液体培养基法（培养基稀释体积为100 mL）对银屑片进行控制菌检查的适用性良好。

表3 用上述控制菌检查方法对银屑片进行控制菌检查适用性验证试验的结果

4 讨论

医院制剂是临床用药不可或缺的一部分，长期以来，其因具有使用方便快捷、价格便宜、疗效佳等优点，在临床治疗服务中发挥着极其重要的作用。由于医院制剂只能在医疗机构内使用，生产规模较小、生产设备较简单，导致制剂质量出现问题的风险较高[8-9]。进行微生物限度检查是控制制剂质量的主要方法之一[10-11]。在为具有抑菌活性的中药制剂选择微生物限度检查方法时，应依据《中国药典》中的相关要求进行相应的适用性试验，以确保其自身抑菌活性不会造成检查结果的偏差[12-14]。本研究的结果显示，用文中所选微生物限度检查方法对银屑片进行微生物限度检查的适用性良好（即银屑片自身的抑菌活性不会造成检查结果的偏差）。综上所述，文中所选微生物限度检查方法可用于对银屑片进行微生物限度检查。