固定化乙酰胆碱酯酶的制备及其在中药抑制剂筛选中的应用*

唐 爽，张红燕，吴仁安，邓仕任，陈晓霞，夏林波

(1 辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600;2 中国科学院大连化学物理研究所，辽宁 大连 116023)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)又被称为老年痴呆，是最常见的神经退行性疾病之一，对老年人的日常生活造成了严重的影响[1]。基于“胆碱能假说”而发掘的乙酰胆碱酯酶抑制剂(Acetylcholinesterase inhibitors，AChEI)也是目前临床治疗AD的最重要的靶点。

本研究以表面修饰羧基的纳米级磁珠为基底材料，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)作为交联剂，将AChE固定在磁珠表面，结合LC-MS/MS的技术，检测与中药提取液共孵育的固定化酶活性，并成功应用到治疗阿尔茨海默病的10种常见中药[3]筛选中。该方法重复性好、准确度高，为发现中药活性成分提供了新的思路与途径。

1 仪器与材料

QTrap 5500三重四极杆线性离子阱串联质谱，美国AB Sciex公司；ACQUITY UPLC超高效液相色谱，沃特世公司；JEOL 2000EX透射电子显微镜，日本电子株式会社；VERTEX 70v红外光谱仪，德国Bruker Daltonics。

羧基磁珠，厦门普睿迈格生物科技有限公司；乙酰胆碱酯酶，北京索莱宝科技有限公司；溴化乙酰胆碱，上海麦克林生化科技有限公司；各中药均购于六安市安竹堂生物科技有限公司。

2 实验方法

2.1 固定化酶制备及条件优化

(1)固定化酶参考文献[4]方法，在MES缓冲液中，通过EDC的交联作用，将AChE固定在羧基修饰的磁珠表面，固定过程如图1所示。

图1 固定化乙酰胆碱酯酶的制备Fig.1 Preparation of immobilized AChE

(2)固定化酶条件的优化从初始酶浓度(2、4、6、8 mg/mL)、孵育时间(1、2、3、4 h)、缓冲液pH(5、6、7、8)、孵育温度(20、25、30、35 ℃)等四个方面进行优化。

(3)酶固载量测定以AChE为标准蛋白，通过BCA法，利用酶标仪测定在570 nm波长下标准溶液(0、0.12、0.24、0.48、0.96、1.2 mg/mL)的吸光度，建立标准曲线；用同样的方法测定反应前、后以及清洗后溶液中AChE的含量，计算酶固载量。

(4)酶活性的测定溴化乙酰胆碱(ACh)在AChE的催化作用下会降解为溴化胆碱。参考文献[5-6]方法对固定AChE进行酶活实验，采用LC-MS/MS技术中MRM模式对所得上清液进行检测，选择m/z 146.8→88.1离子对，测定与固定化AChE反应前后的ACh峰面积，计算固定酶对底物的消耗量，并以消耗量最高者为酶活性100%，计算其他固定条件样品的相对酶活性。

2.2 中药提取液

按1:50的比例将中药粉末用70%乙醇溶液超声提取60 min，离心后取上清浓缩至干，将浸膏复溶于50%甲醇-乙酸铵缓冲液中，得50 mg/mL中药样品溶液；再将其用乙酸铵缓冲液稀释10倍，以5 mg/mL为终浓度。

2.3 中药的抑制性实验

先将固定的AChE与100 μL中药提取液混合15 min，再对其进行酶活实验，磁分离收集上清液，参照“2.1”检测ACh反应前后的峰面积变化情况。以不加中药提取液的固定化AChE重复上述实验,作为空白对照。

抑制率=(S样品-S空白)/(S投入-S空白)×100%

式中：S投入为不加酶时ACh的色谱峰面积；S样品为同时加入固定化AChE时和中药提取液时底物ACh的色谱峰面积；S空白为仅加入固定化AChE时底物ACh的色谱峰面积。

3 结果与讨论

3.1 固定化酶结构表征

扫描电镜结果如图2所示，从图2(a)中可以看出，未固定酶的磁珠粒径均匀、分散性好；而图2(b)中的磁珠表面模糊，并出现明显的聚集现象，说明磁珠在AChE的作用下出现粘连情况，即AChE被固定在磁珠表面。

红外光谱表征结果如图3所示，1068.31 cm-1处的红外吸收峰属于羧基磁珠中Si-O的伸缩振动，图3(b)中1548.47 cm-1、1644.89 cm-1处的红外吸收峰分别为肽键中N-H的弯曲振动和C=O的伸缩振动，对比可知图3(a)中并不具备肽键的吸收峰,说明AChE被成功的固定在磁珠表面。

图2 羧基磁珠(a)和固定化AChE羧基磁珠的 透射电镜表征图固定化(b)Fig.2 Tem image of Carboxyl magnetic beads (a) and immobilized AChE (b)

图3 羧基磁珠(a)和羧基磁珠(b)的 AChE的红外光谱图Fig.3 IR spectra of carboxyl magnetic beads(a) and immobilized AChE (b)

3.2 固定化酶条件的优化

在AChE固定化过程中，初始酶浓度和缓冲液pH对酶固载量和酶活性影响较大，初始酶浓度的升高，引起酶固载量及催化效率的上升；而缓冲pH的提高，则导致酶固载量及酶活性的明显下滑。孵育时间以及孵育温度对酶固载量和酶活性的影响较小。最终确定的反应条件为：AChE浓度8 mg/mL、孵育时间4 h、缓冲液pH值5.0、孵育温度为20 ℃。

3.3 中药的抑制活性

图4 中药抑制活性测试LC-MS/MSFig.4 LC-MS/MS of traditional Chinesemedicine inhibitory activity test

中药抑制活性实验中底物ACh的LC-MS/MS检测结果如图4所示。可见，仅加入固定化酶和底物时，AChE面积很小，表明酶活性很高(图4b)；当同时加入固定化AChE时和川芎提取液时，ACh面积显著增加，表明酶活性受到明显抑制(图4c)。

在10种用于治疗AD的常用中药中，我们成功筛选出石菖蒲、川芎、茯苓、当归等四种中药具有较强的AChE抑制活性(图5)。

图5 治疗AD常用中药对固定化AChE的抑制率Fig.5 Inhibition rate of AChE immobilized by traditional Chinese medicine in treating AD

4 结 论

本实验以羧基磁珠为基底材料，通过EDC的交联作用，将乙酰胆碱酯酶固定在磁珠表面，并对固定条件进行优化，结合LC-MS/MS的方法，最终将其运用到治疗老年痴呆常用的单味中药中，通过酶活反应得到石菖蒲、川芎、茯苓、当归对乙酰胆碱酯酶有较强的抑制作用。其中石菖蒲、当归中的AChEI已有明确报道，而川芎、茯苓中对乙酰胆碱酯酶有抑制性的活性成分却鲜有提及，我们后续将进一步对川芎、茯苓中的AChEI开展深入研究。