HPLC-DAD 波长切换同时测定鸡精中两种合成着色剂

唐 莉，许艳萍

（镇江市食品药品监督检验中心，江苏镇江 212000）

食物色泽丰富，会增加人的食欲，使人心情愉悦。适量加入符合标准规定的食用着色剂，可以满足各类消费者对色泽的不同要求，从而使得食物的特征风味直观鲜明，让人充满对食物味道的想象，从视觉、嗅觉、味觉上充分吸引顾客。黄色能产生令人振奋的效果，刺激大脑活动情况，让人感受到温暖与舒适，结合鸡精配料表中的鸡肉粉，让人联想到那一碗冒着热气的黄澄澄的鸡汤，因此鸡精生产企业会在鸡精的配料中添加食用色素。食用色素可分为食用天然色素与食用合成色素。部分合成色素可能具有毒性，但由于多数合成色素成本低廉、色泽鲜艳、着色力强以及色调多样，仍被广泛应用。据报道，合成色素有致泻、致癌性，可诱发支气管哮喘、荨麻疹及血管性浮肿等变态反应。为了防止其危害，我国在其使用上都作了严格的限制。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[1]规定，固体调味料中柠檬黄、日落黄限量值均≤0.2 g/kg。

在鸡精中涉及的人工合成色素主要是柠檬黄和日落黄两种，相关现行的国家标准方法主要为《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》（GB 5009.35—2016）[2]，该标准的适用范围为饮料、配制酒、硬糖、蜜饯、淀粉软糖、巧克力豆及着色糖衣制品中合成着色剂的测定，并未包含鸡精调味料。本文在GB 5009.35—2016 的基础上，经参考《水果罐头中中合成着色剂的测定 高效液相色谱法》（GB/T 21916—2008）[3]（适用于水果罐头）、《食品中的诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测 高效液相色谱法》（SN/T 1743—2006）[4]（适用于糖果、饮料）等国家和行业标准，经过大量的实践，结合鸡精调味料的特性，建立了一种同时测定鸡精调味料中柠檬黄、日落黄的高效液相色谱法，取得了满意的结果。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

高效液相色谱仪，安捷伦1260 Infinity 带DAD（二极管阵列）检测器；色谱柱，C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）岛津；电子天平，梅特勒，XSE205DU；超声波清洗器，科导；离心机，赛默飞，ST16；Tube Mill control 研磨机，艾卡；涡旋振荡器，海门其林贝尔仪器制造有限公司。

1.2 材料与试剂

市场销售的5 种普通鸡精调味料；甲醇（色谱纯）、乙酸铵（色谱纯），国药集团化学试剂有限公司；柠檬黄标准品（CAS：1934-21-0、250 mg/瓶），北京谱析标准技术有限公司；日落黄标准品（CAS：2783-94-0、250 mg/瓶），北京谱析标准技术有限公司；聚酰胺粉（过200 目），上海麦克林生化科技有限公司；柠檬酸（分析纯）、氨水（分析纯）、乙酸（分析纯）、钨酸钠（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、甲酸（分析纯），均为国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 高效液相色谱分析条件

柱温：30 ℃；检测波长：0 ～6 min ，428 nm ；6 ～25 min，484 nm。流动相流速和梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相流速和梯度洗脱程序

1.3.2 样品提取

称取5 g 左右粉碎均匀的鸡精样品于50 mL 离心试管中，加入30 mL 水，涡旋振荡2 min，置于60 ℃水浴中超声20 min，冷却后定容到50 mL，6 000 r/min离心3 min（对于蛋白含量高的样品，在定容前加入1 mL10%钨酸钠溶液沉淀蛋白），取上清液过0.45 μm滤膜过滤，供液相色谱测定[5]。

1.3.3 标准曲线制作

准确称取100 mg 柠檬黄、日落黄标准品用水定容至100 mL，配成1 mg/mL 的标准储备液。逐级稀释标准储备液为1.00 μg/mL、3.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.00 μg/mL、20.00 μg/mL 和50.00 μg/mL 6 个浓度，按照上述色谱条件进样，以各色素峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作标准曲线。

1.4 结果计算

试样中各着色剂含量按如下公式计算：

式中：X为试样中各着色剂的含量，g/kg；c为从标准曲线上查得进样液中各着色剂的浓度，μg/mL；V为试样稀释总体积，mL；m为试样质量，g；1 000为换算系数。

2 结果与分析

2.1 前处理的选择与优化

市售的5 种鸡精，先按照GB 5009.35—2016 中固体的色素提取方法，发现在聚酰胺吸附过程中呈糊状，抽滤困难，导致试验难以进行。后改进方法用提取出色素的溶液吸附[6]，相对国家标准取得了较好的操作效果。但缺点是前处理耗时较长，步骤多，损耗大，高中低3 种浓度下两种色素回收率在83.2%～91.5%，回收率偏低。

笔者查阅鸡精产品的标准[7]和生产工艺，结合实物配料表，发现鸡精的配料并不复杂，基质对检测目标物的干扰非常小。另外，鸡精颗粒干燥，易溶于水，柠檬黄和日落黄水溶性也较强，根据这些特性，笔者决定采用直接用高纯水在一定温度下超声提取的方法，再通过高速离心机离心，沉淀淀粉等物质得到较纯净的分析溶液。试验证明该提取方法对市售的5 种鸡精都能比较充分地提取出目标物质，色谱峰分离度较好，噪声和干扰较小，对2 种色素都有较好的回收率，且操作快速简便。

2.2 色谱条件的选择

根据现行国家和行业标准，流动相均采用甲醇-乙酸铵溶液（0.02 mol/L）。按照GB 5009.35—2016 设置流动相的梯度洗脱程序，0 ～3 min，甲醇5%～35%；3 ～7 min,甲醇35%～100%；100%继续3 min；回到5%，试验发现由于流动相的变化速率大，带来基线的平稳度减小，而梯度洗脱程序参照GB/T 21916—2008，流动相的变化速率平缓，和GB 5009.35—2016 的梯度程序相比，基线噪声和漂移小，在得到较好的峰型和分离的同时，柠檬黄和日落黄的信噪比提高，检测灵敏度增加。

2.3 检测波长的选择和优化

在400 ～700 nm 用DAD 检测器对标准溶液进行光谱全扫描，柠檬黄、日落黄紫外可见光谱图见图1。

图1 柠檬黄（上图428 nm）、日落黄（下图484 nm）紫外可见光谱图

选择各自最大的吸收波长，柠檬黄波长选择428 nm，日落黄波长选择484 nm。根据此二波长通道的重叠色谱图，如图2、图3 所示，柠檬黄和日落黄在各自的波长内响应值较大(粗线峰为428 nm，细线峰为484 nm)，提高了检测的灵敏度，且出峰处基线较平稳，有利于定性和定量。

图2 标准溶液柠檬黄、日落黄各10 μg/mL 色谱图（二波长重叠）

图3 样品溶液加标柠檬黄、日落黄各10 μg/mL 色谱图（二波长重叠）

根据峰分离情况设置波长切换时间程序，在0 ～6 min 为428 nm，柠檬黄出峰后切换波长为484 nm，得到较好的色谱图和基线，见图4。最终确定使用该波长程序方法进行标准溶液和样品的分析。

图4 波长切换程序下样品溶液加标柠檬黄、日落黄各10 μg/mL 色谱图

2.4 标准曲线和检出限

根据1.3.3 中的6 个标准溶液绘制标准曲线。以S/N=3，即以3 倍信噪比计算检测限，以S/N=10，即以10 倍信噪比计算定量限。线性范围、回归方程、检测限、定量限见表2。由表2 可知，柠檬黄和日落黄在1 ～50 μg/mL 的浓度下，相关系数（R2）分别为0.999 89 和0.999 99，线性关系良好，检出限均为0.15 mg/kg，小于国家标准GB 5009.35—2016 和GB/T 21916—2008 的 检 出 限，满 足 检 测需求。

表2 标准曲线、线性范围和检出限

2.5 精密度

按照上述色谱条件对同一鸡精样品平行测定6次，结果见表3。由表3 可知，RSD 值在1.5%～2.3%，符合实验室质量控制规范要求，表明该方法具有良好的精密度。市售5 种鸡精有2 种配料添加柠檬黄，均未添加日落黄，日落黄均未检出。

表3 精密度试验结果

2.6 回收率

对不含有色素的鸡精样品进行加标，称取9 份阴性样品，每份5.0 g，分为3 组，每组添加浓度分别为1.0 μg/mL、10.0 μg/mL、50.0 μg/mL，每个加标水平重复3 次，计算回收率，见表4。在添加高中低3 种浓度下，样品加标回收率在93.0%～100.1%，满足定量分析需求。

表4 回收率试验结果

3 结论

本文建立了鸡精中柠檬黄、日落黄含量测定的高效液相色谱方法，结果表明该方法测定结果准确度较高，且前处理简便迅速，为鸡精调味料、鸡粉调味料及其他类型的复合调味料的食品安全监督抽检及其他类型检验工作提供了参考。