基于响应面法的粘质沙雷氏菌BRC-CXG2发酵培养基优化

李金荣, 周彤, 林一琪, 黄祚骅, 盛亮菁, 张飞萍, 吴松青

（1.福建农林大学林学院, 福州 350002；2.福建农林大学生命科学学院, 福州 350002；3.福建农林大学生态公益林重大有害生物防控福建省高校重点实验室, 福州 350002）

松材线虫病又称松树萎蔫病（pine wilt disease）, 是 由 松 材 线 虫（Bursaphelenchus xylophilus）引起的检疫性森林病害, 具有传播速度快、防治难度大等特点, 不仅给我国林业造成巨大的经济损失, 也对景观生态造成了严重破坏[1]。据报道, 在松材线虫的传播和感染的过程中, 松墨天牛起着携带、扩散和协助病原侵入寄主的关键性作用, 被认定为松材线虫病的主要媒介昆虫[2-3]。粘质沙雷氏菌既是松材线虫的主要伴生细菌[4-5], 又是松墨天牛肠道的优势菌, 且该菌对松墨天牛具有一定的杀虫活性[6]。一方面其可以促进天牛生长, 另一方面又为机会致病菌。因此, 可利用该菌的伴生和致病能力对松墨天牛进行生物防治, 具有很强的生防潜力。

为了进一步开发粘质沙雷氏菌（Serratia marcesens)的应用潜能, 需要对其进行大量培养, 以满足大规模的生产实践需求, 因此, 本研究将对该菌发酵培养基进行筛选与优化。粘质沙雷氏菌培养基优化方法不一, 主要包括正交试验设计法、单因素试验优化以及与其相结合的响应面试验设计法。郝林华等[7]采用正交试验设计, 优化以葡萄糖、硫酸铵、麸皮、柠檬酸三钠等作为粘质沙雷氏菌的培养基, 最终发酵菌含量为50×108cfu·mL-1；布佐日古丽·喀迪尔等[8]采用单因素试验优化了粘质沙雷氏菌XJU-PA-6的最佳发酵条件, 最佳碳源为麦芽糖, 最佳氮源为蛋白胨, 优化后培养基的菌体生物量大概为8.7 g·L-1, 是基础培养基的3.10倍。但为了实现工业化生产, 进一步提升其发酵水平, 加速其发酵过程, 本研究采用更为快速经济的培养基优化方法——响应面法[9], 对粘质沙雷氏菌的培养基进行优化, 以期筛选出最优化的培养基配方,为粘质沙雷氏菌工程菌的规模化发酵生产奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株 试验所用粘质沙雷氏菌BRC-CXG2菌株由本课题组前期分离自松墨天牛二龄幼虫肠道并保存[6]。

1.1.2 主要试剂和培养基 蛋白胨（分析纯）、酪素（化学纯）购自国药集团化学试剂有限公司；麦芽提取粉、酵母提取粉（生化试剂）购自广东环凯微生物科技有限公司；硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸铵均为分析纯, 购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；胰蛋白胨、酵母粉均为分析纯, 购自OXOID有限公司；琼脂粉购自北京兰杰柯科技有限公司；黄豆饼粉购自北京鸿润宝顺科技有限公司。

种子液LB培养基：胰蛋白胨10 g·L-1, 酵母粉5 g·L-1, 氯化钠10 g·L-1, pH 7.1~7.3, 121℃灭菌20 min；固体LB培养基：胰蛋白胨10 g·L-1, 酵母粉5 g·L-1, 氯化钠10 g·L-1, 按1.5%的比例加入琼脂粉, pH 7.1~7.3, 121℃灭菌20 min, 倒板备用；初始发酵培养基：黄豆饼粉5 g·L-1, 酪素10 g·L-1, 蚕 蛹 粉10 g·L-1, 磷 酸 氢 二 钾2 g·L-1, 氯 化 钠2 g·L-1, pH 7.1~7.3, 121℃灭菌20 min。

1.1.3 主要仪器设备MLS-3781L-PC高压蒸汽灭菌器, 松下健康医疗器械株式会社；HYG-A全温摇瓶柜, 苏州市培英实验设备有限公司；DHG-9030A电热鼓风干燥箱, 上海一恒科学仪器有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱, 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2FD洁净工作台, 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；NBL 214e电子天平, 艾德姆衡器（武汉）有限公司；ST3100实验室pH计, 奥豪斯仪器（常州）有限公司；LEICA M205 FA全自动荧光立体显微镜, 徕卡微系统有限公司。

1.2 试验方法

在无菌条件下, 取粘质沙雷氏菌（BRCCXG2）的保存菌液按体积分数1%的量接种于5 mL的LB液体培养基中, 置于30℃、200 r·min-1摇床中培养12 h。然后将种子液按体积分数1%的接种量转接到装有50 mL发酵培养基的250 mL的锥形瓶中, 在28℃、150 r·min-1培养36 h后, 采用稀释平板计数法[10], 通过LEICA M205 FA全自动立体显微镜统计菌落数量。

将发酵好的菌液梯度稀释10-1~10-15倍, 各吸取100μL均匀涂布在固体LB培养基上, 静置5 min, 待培养基表面干燥后封口, 放入温度为28℃生化培养箱中倒置培养12 h, 每个梯度重复3次, 统计单菌落数量。

1.3 单因素试验

基于初始发酵培养基, 分别设置不同温度（25、28、30和37℃）、不同装液量（25、50、100 mL/250 mL）及不同转速（150、200、230 r·min-1）, 研究发酵条件对粘质沙雷氏菌发酵菌落数的影响。

参照初始发酵培养基, 设置单因素试验研究培养基成分对粘质沙雷氏菌发酵菌落数的影响。分别设置2.5、5.0、10.0 g·L-1的碳源（葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、油酸、淀粉）；10、20、40 g·L-1的氮源（硫酸铵、酵母粉、乙酸铵、蛋白胨, 再分别添加酪素和蚕蛹粉）以及1、2、4 g·L-1的无机盐（柠檬酸三钠、磷酸氢二钠、硫酸镁、硫酸铜、硫酸亚铁）, 固定其他成分不变, 灭菌后按体积分数1%接种, 并在28℃、150 r·min-1的条件下培养36 h, 统计菌落数量。

1.4 Plackett-Burman试验

根据单因素试验结果, 采用Plackett-Burman（PB）试验对影响粘质沙雷氏菌BRC-CXG2菌落数量的因素进行评价[11]。11个因素的水平设置如表1所示, 每个因素分别设计低（-1）、高（+1）水平。X3、X6、X9表示的是虚拟变量, 用于考察试验误差。试验次数为12次, 重复3次, 筛选出3个影响显著的因素。

表1 Plackett-Burman试验因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman test

1.5 最陡爬坡试验

根据PB试验结果筛选出对菌株生长影响最显著的因素, 分别为葡萄糖、蚕蛹粉和接种量。通过Design Experts 8.0.6软件的Plackett-Burman分析功能对PB试验结果进行显著性分析, 从中筛选出 影 响 显 著（P＜0.05）的 因 素, 基 于Plackett-Burman试验分析拟合出的显著性方程设置最陡爬坡试验中3个影响因素的爬坡方向和步长间距, 以期逼近最佳响应区域。

1.6 响应面分析与验证试验

根据最陡爬坡试验结果确定其最适质量浓度范围, 运用Box-Behnken试验设计, 对培养基的每个因素条件进行优化。通过二阶设计原理, 3因素（葡萄糖、蚕蛹粉及接种量）各取3水平（-1, 0, 1）, 共设计了17个组合的响应面试验[12-13]。其中包括5个中心点, 试验重复3次, 以确定各因素对菌株BRC-CXG2菌体生长量影响的显著性和最适质量浓度范围。然后对Box-Behnken试验结果进行方差分析, 拟合线性回归方程。利用拟合方程得到最佳培养条件, 并在此条件下进行验证试验。

1.7 数据处理

使用Excel 2020进行数据统计、作图与分析, 分别用Design Experts 8.0.6、Origin 2021、GraphPad Prism 9与IBM SPSS Statistics 22。

2 结果与分析

2.1 不同培养条件对发酵菌落数的影响

图1结果显示, 温度过高或过低都不利于粘质沙雷菌体的生长, 温度在28℃时菌落数最高, 为32.9×107cfu·mL-1, 因此, 28℃为最适菌株生长温度。装液量为50 mL时, 发酵菌落数均高于装液量25 mL和100 mL, 因此装液量最适体积分数为50/250 mL；当转速达到230 r·min-1时该菌菌落数最高, 但考虑摇床长时间处于该转速工作时可能出现的安全性问题, 故选择150 r·min-1进行培养基优化。

图1 不同温度、装液量和转速下的粘质沙雷氏菌菌落数Fig.1 Colonies number of Serratia marcescens under different temperatures, loading volumes and rotational speeds

2.2 单因素对菌落数量的影响

2.2.1 不同碳源对粘质沙雷氏菌菌落数量的影响 将不同种类及质量浓度碳源分别替换初始培养基中的黄豆饼粉, 对粘质沙雷氏菌的菌落数进行统计。结果（图2）表明, 油酸为10.0 g·L-1的条件下菌落数最大, 为1.42×109cfu·mL-1, 但与葡萄糖的结果（1.39×109cfu·mL-1）差异并不明显。当碳源含量为5.0 g·L-1时, 葡萄糖对发酵菌落数量的影响明显大于其他碳源因子。考虑成本问题, 将葡萄糖与油酸同作为碳源加入到培养基中, 进一步优化比值。

图2 不同碳源下的粘质沙雷氏菌菌落数量Fig.2 Colonies number of Serratia marcescens under different carbon sources

2.2.2 不同氮源对粘质沙雷氏菌菌落数量的影响 将不同种类及浓度氮源分别替换初始培养基中的酪素和蚕蛹粉, 对粘质沙雷氏菌的菌落数进行统计。结果（图3）表明, 初始发酵培养基氮源40 g·L-1时的菌落数量最大, 为9.7×108cfu·mL-1, 但从生产成本的角度考虑, 酪素的价格较为昂贵, 不符合大规模生产实践要求, 故选择菌落数为7.8×108cfu·mL-1的蚕蛹粉和20 g·L-1的酵母粉组合作为粘质沙雷氏菌的最佳氮源。

图3 不同氮源下的粘质沙雷氏菌菌落数量Fig.3 Colonies number of Serratia marcescens under different nitrogen sources

2.2.3 不同无机盐对粘质沙雷氏菌菌落数量的影响 将不同种类无机盐分别替换初始培养基中的磷酸氢二钾, 对粘质沙雷氏菌的菌落数进行统计。结果（图4）表明, 加入2.0 g·L-1的硫酸镁, 发酵菌落数值最高为1.11×109cfu·mL-1。同时, 磷酸盐类在培养基中起着调节pH及缓冲等重要作用。由于磷酸氢二钾与硫酸镁混合会生成磷酸氢镁沉淀, 磷酸氢二钠与硫酸镁则不发生反应。故用于Plackett-Burman设计的无机盐分别是硫酸镁和磷酸氢二钠。

图4 不同无机盐下的粘质沙雷氏菌菌落数量Fig.4 Colonies number of Serratia marcescens under different inorganic salt sources

2.3 Plackett-Burman试验设计与检测结果分析

表2所示的是Plackett-Burman试验设计方案与菌落数检测结果。将所得到的结果进行拟合, 方程模型如下。

表2 Plackett-Burman试验设计方案与检测结果Table 2 Design and results of Plackett-Burman test

根据该方程可知, 因素X1（油酸）、X2（葡萄糖）、X4（蚕蛹粉）、X10（接种量）分别呈现不同的正（+）负（-）系数, 即X1（油酸）为负效应系数, 当加入油酸到一定量时, 则菌落数依次减小；X2（葡萄糖）、X4（蚕蛹粉）和X10（接种量）均为正效应系数, 依次增大。

方差分析（表3）表明,R2=0.983 9, 说明这个模型的结果仅有1.61%不可信。且该模型的P值为0.013 1, 模型显著（P＜0.05）, 说明模型拟合良好。在8个变量中, 对菌落数量影响较显著（P＜0.05）的4个因素从大到小为：蚕蛹粉＞葡萄糖＞接种量＞油酸。由于油酸生产成本偏高, 不再考虑优化。因此, 确定葡萄糖、蚕蛹粉与接种量为影响菌落数量的重要因素, 进行最陡爬坡试验。

表3 Plackett-Burman试验方差分析Table 3 Analysis of variance for the Plackett-Burman test

2.4 最陡爬坡试验设计与结果

本试验将培养基成分设计了6个水平（表4）, 随着葡萄糖、蚕蛹粉和接种量值的增加, 发酵菌落数呈现先升高后下降的变化趋势, 4号的菌落数达到最大值34.37×108cfu·mL-1, 因此确定为因子的最大响应值响应区域, 然后围绕此区域设计Box-Behnken试验的中心点。

表4 最陡爬坡试验设计及结果Table 4 Design and results from the steepest ascent experiment

2.5 响应面分析优化培养基组成与方差分析结果

根据PB设计和最陡爬坡试验结果（表5）, 分别确定3个最重要因素和最佳质量浓度范围, 以菌落数（Y）为响应值,X1（葡萄糖）、X4（蚕蛹粉）、X10（接种量）为自变量, 采用中心组合设计进行Box-Behnken试验。通过响应面分析可以得到多元二次回归方程。

表5 响应面分析法试验设计与结果Table 5 Experimental design and results of response surface analysis method

结合回归分析（表6）, 该模型的P值为0.000 5（P＜0.01）, 失拟项影响不显著（P=0.611 7＞0.05）,相 关 系 数（R2）为0.957 0, 校 正 系 数（Radj2）为0.901 7, 说明模型的拟合度较好。模型显著性由大到小排序：X（1葡萄糖）＞X（4蚕蛹粉）＞X1（0接种量）。一次项X（1葡萄糖）和二次项X12、X42、X102对响应值Y（菌落数）影响极显著（P＜0.01）, 交互项X1X4和X4X10显著影响Y值（P＜0.05）, 一次项X4和X10与交互项X1X10对菌落数影响不显著（P＞0.05）。

表6 响应面方差分析的回归模型Table 6 Regression model for response surface analysis of variance

由图5可知, 各个因素交互作用对菌落数影响的响应曲面为抛物线状, 形状轮廓图则表示独立变量间的显著性。轮廓图呈椭圆形, 说明各个因素之间相互作用会影响Y（菌落数）。

如图5A所示,X1（0接种量）值固定不变,X（1葡萄糖）和X（4蚕蛹粉）对发酵菌落数的影响表明, 当X1值为最低质量浓度时,Y值先随着X4值的升高而增加；当X1的值超过最适质量浓度时,Y值随着X4值的升高而下降,Y值的响应面呈现峰值, 即边界的设置包含最优点。如果没有得到完整的椭圆形状的等高线图, 说明边界的设计不包含最优点。当X4值保持不变时,X1和X10对Y值的影响如图5B所示。X1值较低时, 随着X10的提高,Y的值呈明显的抛物线状, 先增加达到最优时最大, 后下降。同理,X1值不变,X2和X3均出现各自的最优值, 使Y达到峰值（图5C）。而3个曲面的顶点反映菌落数的最高点即最佳培养基成分与最佳用量。

图5 各因素交互作用下菌落数的响应面及等高线Fig.5 Response surface and contour plots of colony number under the interaction of various factors

通过分析等高线图可得到预测最优值。预测最 优 条 件 为：23.27 g·L-1葡 萄 糖、22.37 g·L-1蚕蛹粉和4.73 %接种量, 预估的菌落数为5.67×109cfu·mL-1。故最终培养基成分及培养条件为：23.27 g·L-1的葡萄糖、22.37 g·L-1的蚕蛹粉、10 g·L-1酵母粉、2 g·L-1硫酸镁、3 g·L-1磷酸氢二钠、2 g·L-1氯化钠, 28℃、150 r·min-1条件下发酵36 h, 培养基装液量体积分数为50 mL/250 mL, 接种4.73%的菌液。

2.6 优化后培养基的发酵结果

按所得到的最优培养基配方进行发酵, 验证所预测的菌落数是否准确。试验所获得的平均菌落数是6.0×109cfu·mL-1, 与预 测菌落数结果（5.67×109cfu·mL-1）非常接近。因此, 可以证明这个模型准确性较高, 可预测实际发酵情况。此外, 结果表明, 最优培养基发酵的菌落数（6.0×109cfu·mL-1）在现有的最佳培养基基础上（6.37×108cfu·mL-1）提 高 了9.42倍, 达 到 预 期目标。

3 讨论

优化发酵微生物培养基是提高生物防治效果的重要手段[14]。优化内容主要包括培养基的组成成分与培养条件, 如温度、pH、发酵时间、装液量等因素对发酵菌体生物量有着不同程度的影响, 有研究发现培养基的主要成分以及各因素之间的相互作用对粘质沙雷氏菌发酵具有极其重大的影响[7,15-16], 与此同时培养温度在菌体生长过程中也发挥着至关重要的作用。

郝林华等[7]对分离于湿地盐碱滩地土壤的粘质沙雷氏菌进行发酵, 主要是对该菌培养基的碳、氮源及无机盐进行优化, 其优化培养基配方中碳、氮源与无机盐的成分含量分别是葡萄糖10 g·L-1, 硫酸铵5 g·L-1, 麸皮50 g·L-1, 柠檬酸三钠1 g·L-1, 最终发酵菌数为50×108cfu·mL-1, 发现碳氮源及两因素之间的交互作用对菌体生长影响较大, 而无机盐次之。薛建等[15]研究的粘质沙雷氏菌筛选于光合细菌菌剂, 对该菌培养基种类和用量进行优化发现, 5 g·L-1的黄豆粉作为碳源时,菌体生长量是原来基础培养基的1.72倍, 以10 g·L-1酪素和蚕蛹粉作为氮源, 生物量比原来分别提升了2.04和2.16倍, 以2 g·L-1磷酸氢二钾作为无机盐, 发现菌体产量是之前的1.15倍。由此说明, 对该菌发酵菌液影响最大的是氮源, 其次为碳源和无机盐。李元芳等[16]优化粘质沙雷氏菌产2,3-丁二醇培养基时发现80 g·L-1蔗糖、5 g·L-1酵母粉及0.07 g·L-1硫酸锰及10 g·L-1柠檬酸对菌体生物量的提高起着重要作用, 按影响从大到小依次排序为柠檬酸＞酵母粉＞硫酸锰＞蔗糖。即柠檬酸和氮源对发酵产量影响最大, 其次为无机盐和碳源。

本研究中发酵的粘质沙雷氏菌分离自松墨天牛幼虫肠道, 影响因素重要性由大到小分别为氮源＞碳源＞无机盐, 这与郝林华等[7]和薛建等[15]的研究结果一致。与李元芳等[16]的研究结果区别在于碳源与无机盐对发酵生物量影响程度的差异, 其研究表明无机盐对菌体生长的重要性大于碳源因子, 而本研究结论与之相反, 原因可能是由于试验目的差异性, 前者研究目的是如何使粘质沙雷氏菌产大量2,3-丁二醇, 所以对培养基的成分选择上更多的考虑如何促进2,3-丁二醇的产量, 而非提高菌体自身生物量, 其研究表明无机盐在细胞代谢过程中起着至关重要的作用, 因此2,3-丁二醇的产出对无机盐营养需求大于对碳源的需求量。然而, 本研究以提高菌体自身产量为目标, 这与郝林华等[7]研究目的一致, 由于碳源作为生命体生长繁殖所必需的基本营养物质, 在菌体自身繁殖与合成中起着非常关键的作用。所以, 菌体对碳源的需求要大于无机盐。

另外, 本研究发现培养条件也是影响菌体生长的关键因素。尤其是温度对菌体自身繁殖起着极其重要的作用[17-18]。谭文章等[19]报道, 粘质沙雷氏菌在4~37℃的环境下均能生长, 但在37℃的条件下生长最佳。还有学者探究温度对菌体生长的影响表明该菌的生存范围为20~40℃[20], 但赵银娟等[17]研究发现, 从土壤中分离到的粘质沙雷氏菌最适生长温度为28~30℃；祁正华等[21]对粘质沙雷氏菌培养条件进行了优化, 该菌株于健康人皮肤分离且经过生物技术诱导, 该菌最佳生长温度为30℃。前人对菌体生长影响因素的重要性及最佳培养温度报道不一, 其原因可能是不同产地不同来源的菌株间存在特异性, 故菌株所需的营养成分含量和培养条件也会存在差异。

综上所述, 本研究得到最优配方与培养条件为23.27 g·L-1的葡萄糖, 22.37 g·L-1的蚕蛹粉, 10 g·L-1酵母粉, 2 g·L-1硫酸镁, 3 g·L-1磷酸氢二钠, 2 g·L-1氯化钠；在28℃、150 r·min-1条件下发酵36 h, 装入50 mL/250 mL培养基, 接种量为4.73 %, pH 7.1~7.3, 菌落数达到60×108cfu·mL-1。郝林华等[7]优化后的活菌数为50×108cfu·mL-1, 与之相比不仅产量上有所提升, 而且发酵时间也缩短了一半, 从而大大节约了时间成本, 使发酵过程变得更加高效、高产, 为后续粘质沙雷氏菌生物工程菌剂的应用提供重要技术支撑。