不同加工方法对薤白活性成分及抗氧化活性的影响

王 荣， 杨元娇， 郭雅迪， 张 晶

(吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118)

薤白来源于百合科葱属多年生草本植物小根蒜AlliummacrostemonBge.或藠头AlliumchinenseG.Don的干燥鳞茎，主产东北、河北、江苏等地[1]，应用于胸痹的治疗。薤白中含有甾体皂苷、挥发油、多糖等成分，具有抑制血小板聚集、抗肿瘤、抗氧化等作用[2]。新鲜薤白含水量较大，放置后易腐烂变质，因此需要及时加工处理。薤白蒸透或置沸水中烫透，晒干，在对薤白的研究中亦有直接烘干或冻干等加工方法。由于中药成分组成的复杂性，中药的质量不但受其品种、产地、采收季节等因素的影响，与加工方法是否适当也有很大的关系[3]。近年来，有学者提出在化学含量测定的基础上，开展生物活性测定，可以综合评价并控制中药的质量[4]。中药的疗效与其抗氧化作用密切相关，而薤白具有一定的抗氧化活性，有望开发成一种良好的天然抗氧化剂。以新鲜薤白鳞茎为原料，采用冻干、直接烘干和煮后烘干3种加工方法处理，探讨不同加工方法对薤白化学成分和抗氧化活性的影响，以期为薤白的药材质量控制和药理活性研究提供参考。

1 材料

新鲜薤白于2019年10月中旬采挖于吉林农业大学校园内，经吉林农业大学中药材学院张晶教授鉴定为百合科植物薤白AlliummacrostemonBunge,剪掉须根和茎叶，鳞茎快速冲洗掉泥沙，沥干，备用。

薯蓣皂苷元对照品(纯度≥98%，北京世纪奥科生物科技有限公司，批号BWB50228)；L-精氨酸对照品(纯度≥98%，上海哈灵生物科技有限公司，批号HLZB-339)；芦丁对照品(纯度≥98%，合肥博美生物科技有限责任公司，批号BZP0103)。无水葡萄糖对照品(纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司，批号B21882)；1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)及其他试剂均为分析纯。

XB120A电子分析天平(瑞士Precisa公司)；KQ5200DB数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱(上海申贤恒温设备厂)；SC-3614低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；Telstar*LyoQuest冻干机(北京昊诺斯科技有限公司)；SPECTRO star Nano全波长扫描式酶标仪(德国BMG Labtech公司)。

2 方法

2.1 加工方法

2.1.1 冻干法 将净制品置于-20 ℃冰箱中预冷5 h后，在-40 ℃下冷冻干燥48 h，粉碎，过40目筛，密封保存。

2.1.2 烘干法 将净制品在50 ℃下恒温干燥，粉碎，过40目筛，密封保存。

2.1.3 煮后烘干法 将净制品用沸水煮至透心，捞出沥干水分，在50 ℃下干燥，粉碎，过40目筛，密封保存。

2.2 皂苷含量测定 称取药材3.000 g，75%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并滤液，浓缩至无醇味，正丁醇萃取3次，合并萃取液，减压蒸干，加水定容至50 mL，即得供试品溶液。吸取适量，测定皂苷含量。

参照文献[5]报道方法，精密吸取1 mg/mL薯蓣皂苷元氯仿溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mL，置于10 mL量瓶中，加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴振摇20 min，冷却后用冰醋酸稀释至刻度，摇匀，在451 nm波长处测定吸光度，得方程为A=18.046X+0.040 8(R2=0.999 0)，在0.005～0.025 mg/mL范围内线性关系良好。

2.3 多糖含量测定 称取药材3.000 g，石油醚脱脂，残渣挥至无醚味，加蒸馏水，在80 ℃下浸提3次，每次2 h，合并滤液，减压浓缩至20 mL，浓缩液采用Sevage法除去蛋白，即得供试品溶液。吸取1 mL，测定多糖含量。

参照文献[6]报道方法，精密吸取0.1 mg/mL葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.5、0.7、0.8、1.0 mL，置于试管中，加水补至1 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL、浓硫酸5 mL，摇匀后静止10 min，置于沸水中20 min，静置10 min，在490 nm波长处测定吸光度，得方程为A=5.538X+0.082 2(R2=0.999 1)，在0.02～0.10 mg/mL范围内线性关系良好。

2.4 氨基酸含量测定 称取药材3.000 g，浸入20 mL甲醇中过夜，超声提取30 min，重复2次，合并滤液，加入5 mL 3%盐酸酸化15 min，滤过，滤液蒸干，加水定容至25 mL，即得供试品溶液。吸取1 mL，以L-精氨酸占1.000 g样品比例计算含量。

参照文献[7]报道方法，精密量取0.2 mg/mLL-精氨酸对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于10 mL量瓶中，加水补至1 mL，加入磷酸盐缓冲液、2%茚三酮乙醇溶液各0.1 mL，加水定容至刻度，置于沸水中15 min，取出，冷却至室温，在570 nm波长处测定吸光度，得方程为A=6.468 5X+0.021 6(R2=0.999 1)，在0.02～0.14 mg/mL范围内线性关系良好。

2.5 挥发油含量测定 称取药材10.000 g，水蒸气蒸馏法提取挥发油，石油醚收集，挥尽溶剂，即得挥发油，测定其含量。

2.6 总黄酮含量测定 称取药材3.000 g，加70%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并滤液，减压浓缩，定容至25 mL，即得供试品溶液，在570 nm波长处测定吸光度，总黄酮含量以1.000 g药材中所含芦丁质量表示，得方程为A=10.076X+0.032(R2=0.999 0)，在0.008～0.048 mg/mL范围内线性关系良好。

2.7 总生物碱含量测定 称取药材3.000 g，95%乙醇回流提取，回收溶剂，加1% HCl酸化，滤过，酸水液加氨水碱化至pH 9～10，等量氯仿萃取，回收溶剂，即得总生物碱，采用酸碱滴定法测定其含量。总生物碱用适量乙醇溶解后精密加入H2SO4滴定液(0.01 mol/L)、水各15 mL，甲基红指示剂2滴，NaOH滴定液(0.02 mol/L)滴定至黄色，测定其消耗碱液体积，结果用空白试验校正(以腺苷为基准)。

2.8 体外抗氧化活性测定 称取3种加工品各10.000 g，石油醚(60～90 ℃)水浴回流3次，每次1 h，得醚提取液[8]，一部分残渣加75%乙醇回流提取3次，每次1 h，滤液蒸至无醇味，正丁醇萃取3次，合并萃取液[9]；另一部分残渣加蒸馏水，在80 ℃下浸提3次，每次2 h，合并滤液，得水提液[10]，将3种提取液减压浓缩、冻干，制成不同质量浓度(1、2、4、6、8 、10 mg/mL)，以维生素C为对照品，测定其体外抗氧化活性，每个样品平行3次。

2.9 DPPH自由基清除能力测定 吸取0.4 mmol/L DPPH乙醇溶液150 μL至96孔板中，加入“2.8”项下提取液各50 μL摇匀，室温避光反应30 min，在517 nm波长处测定吸光度，计算清除率[11]。

2.10 ABTS自由基清除能力测定 204 mg ABTS以水定容至50 mL，35.14 mg K2S2O8以水定容至50 mL，合并，摇匀，室温避光反应16 h，乙醇稀释ABTS溶液，使其在734 nm处的吸光度为0.7。吸取“2.8”项下提取液各80 μL，加入ABTS溶液140 μL，室温避光反应30 min，在734 nm波长处测吸光度[12]。

2.11 羟基自由基清除能力测定 取10 mmol/L水杨酸乙醇溶液、10 mmol/L FeSO4溶液、“2.8”项下提取液各50 μL，置于96孔板中，混匀，在37 ℃下恒温反应30 min，加入50 μL 100 mmol/L H2O2溶液，终止反应，在510 nm波长处测定吸光度，计算清除率[13]。

3 结果

3.1 各成分含量测定 表1显示，烘干品中皂苷含量最高，冻干品中多糖、挥发油含量最高；煮后烘干品中皂苷、多糖、氨基酸含量低于鲜品(P<0.01)；各样品中总黄酮、生物碱含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 不同加工品中各成分含量

表2显示，3种提取物中含量较高的成分分别为挥发油、皂苷、多糖，皂苷含量在烘干品中最高，其次在冻干品中；挥发油、多糖含量均在冻干品中最高，其次在烘干品中；煮后烘干品中各成分含量均最低。

表2 不同提取物中各成分含量

3.2 DPPH自由基清除活性 图1显示，水提物具有较强的清除DPPH自由基活性，并呈量效关系，其中冻干品清除能力最强，在10 mg/mL时清除率为67.59%，其次为烘干品，煮后烘干品最弱。

3.3 ABTS自由基清除活性 图2显示，醇提物、水提物清除ABTS自由基的能力较强，并呈量效关系，其中醇提物中烘干品清除ABTS自由基的能力最强，在10 mg/mL时清除率为93.06%，其次是冻干品；水提物中冻干品清除ABTS自由基的能力最强，在10 mg/mL时清除率为78.78%；2种提取物中煮后烘干品清除ABTS自由基的能力最弱。

3.4 羟基自由基清除活性 图3显示，醚提物对OH自由基的清除率较高，并呈剂量依赖性，其中冻干品清除能力最强，在10 mg/mL时清除率为61.63%，其次为烘干品，煮后烘干品最弱；醇提物、水提物对OH自由基的清除能力较弱，活性远低于维生素C。

图1 3种提取物对DPPH自由基的清除活性

图2 3种提取物对ABTS自由基的清除活性

图3 3种提取物对OH自由基的清除活性

3.5 IC50值 表3显示，醇提物对ABTS自由基的清除能力较强，水提物对DPPH、ABTS自由基的清除能力较强，醚提物对OH自由基的清除能力较强，而且后2种提取物中冻干品清除能力最强，其次是烘干品，煮后烘干品最弱。

表3 3种加工品对各自由基的IC50值

4 讨论

不同加工方法对薤白化学成分的含量有显著影响，其中烘干样品中皂苷含量最高，冻干样品中多糖、挥发油含量较高，且挥发油含量与鲜品之间无差异。冷冻干燥对于皂苷类成分的保留没有作用，与关峰等[14]研究一致，其原因可能与冷冻干燥的技术特点和具体工艺有关，低温并未使组织中的酶失活，皂苷水解使得皂苷含量减少而糖含量增加。烘干法中高温能将内源酶灭活或有一定的抑制作用，使得药材自身的呼吸减弱，从而减少皂苷水解[15-16]。加工过程中温度对挥发油类成分有一定的影响，温度过高会导致药材中挥发油成分的流失或转化[17-18]。皂苷、多糖和氨基酸均具有一定的水溶性，因此水煮后这些成分损失较严重。50 ℃恒温干燥能更好地保留皂苷类成分，冷冻干燥对于多糖、挥发油类成分的保留更具优势，因此可根据应用目的合理选择最佳加工方法。

薤白不同提取物的抗氧化活性对不同类型的自由基表现出选择性作用。其中醇提物的正丁醇萃取部位对ABTS自由基清除能力较强，水提物对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力较强，醚提物对OH自由基的清除能力较强，其差异可能与不同提取物中起到抗氧化作用的成分组成及其结构与性质有一定关系[19]。醚提物、醇提物和水提物的抗氧化活性大小分别与挥发油、皂苷和多糖的含量呈现一定的相关性。薤白皂苷[20]、多糖[10]均具有一定的抗氧化活性，有机硫化物因硫氢键的断裂，或与不同的环状结构、烯丙基等基团结合，会产生多种抗氧化活性物质[21]，具有较强的羟自由基清除能力及总还原能力[22-23]，而含硫化合物为薤白挥发油中主要化学成分。因此推测皂苷、多糖和挥发油可能是薤白起抗氧化作用的重要活性成分。