粉防己碱-PLGA 纳米粒的制备及其对骨质疏松模型小鼠的治疗作用

李定林 李倩 刘浩

骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，其特点是骨量低和骨组织微结构退化，从而导致骨脆性增加和骨折易感性[1]。众所周知，破骨细胞介导的骨吸收超过成骨细胞介导的骨形成，导致骨微结构退变，继而导致骨质疏松[2]。因此，目前治疗骨质疏松症的策略主要集中在抑制破骨细胞活性或诱导骨形成上。抑制破骨细胞活性的药物如双磷酸盐、地诺单抗等，这些药物会引起许多不良反应，如长期使用双磷酸盐可能会导致包括颌骨坏死、股骨转子下骨折、心房颤动和骨转换抑制[3-5]。促进骨形成的药物 (如甲状旁腺激素、雷尼酸锶等)在使用过程中也发现了一些问题，如阿巴洛肽和特立帕肽(分别是一种甲状旁腺激素相关肽和一种甲状旁腺激素的活性片段)给药后出现恶心、注射部位反应、腿抽筋和头晕及骨肉瘤风险增加[6]。而雷尼酸锶会增加心血管风险[7]。因此，需要开发新型安全药物来治疗骨质疏松症。

粉防己碱 (tetrandrine，TET)是一种双苄基异喹啉生物碱，从粉防己的根中提取的，它具有抗炎和免疫抑制作用，对类风湿性关节炎具有强大的治疗潜力[8-15]。近来有人发现 TET 可以显著预防卵巢切除术引起的骨质流失并抑制 (receptor activator of NF-kB ligand，RANKL)诱导的破骨细胞生成[16]。因此，笔者推测 TET 可能是治疗骨质疏松症的潜在药物。但由于它的水溶性差，只可溶于某些溶剂，因此临床应用受到限制。

纳米医学的兴起有望克服这些限制，聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物 [ poly (lactic-co-glycolic)acid，PLGA ] 经美国食品药品管理局 (Food and Drug Administration，FDA)认证，具有无毒、可生物降解和生物兼容等特性[17]。笔者采用纳米沉淀法制备了 PLGA 纳米粒子[18]，该纳米粒可以同时包裹亲水和疏水化合物，并且可以保护它们包裹的药物不被降解，确保药物缓慢和持久的释放[19]。因此，笔者同样采用纳米沉淀法合成了包裹 TET-PLGA 纳米粒 (PLGA @ TET NPs )，以便更好地在临床中使用 TET，以期能为骨质疏松症提供新的治疗依据。

资料与方法

一、实验动物

12 周龄的雌性 C57BL / 6 小鼠由华中科技大学实验动物中心提供。所有小鼠都被饲养在动物中心的无特定病原体 (specific pathogen-free，SPF)房间里。本研究涉及的所有动物护理方案和实验均符合华中科技大学实验动物中心批准的方案。

二、主要试剂与仪器

1. 试剂：TET (美国 Sigma 公司，含量＞99% )；PLGA (上海 Macklin，相对分子量：7000-17000，批号：p875219 )；维生素 E 聚乙二醇琥珀酸酯 (Vitamin E-TPGS，上海 Macklin，批号：V819469)等。

2. 仪器：Ultrasonifier 超声均化仪；高效液相色谱仪等。

三、研究方法

1. 色谱条件[20]色谱柱：Hypersil ODS C18 柱，4.0 mm×250 mm，Φ 5 μm。流动相为甲醇：水(80∶20，V / V )，含 0.03%三乙胺，流速 1.0 ml·min-1。紫外检测波长 282 nm。

2. 载 PLGA @ TET NPs 的制备：纳米沉淀法制备载 PLGA @ TET NPs。简言之：称取 10 mg PLGA粉末及 1 mg TET 溶于 2 ml 丙酮中。在持续地搅拌下(400 rpm)将上述溶液缓慢滴加 (3 ml / min)入重量比为 0.2% 的 TPGS 水溶液中。滴加完毕后，继续搅拌待有机相挥干后，以 2500 rpm 的离心速度将纳米粒溶液离心 15 min，舍弃沉淀留上清，以 11800 rpm 的离心速度将上清离心 25 min，倒上清，将纳米粒重新分散于 3 ml 超纯水中，冷冻干燥 36 h，得白色纳米颗粒粉末，并将其储存于 -20 ℃ 备用。

3. 线性范围考察：精密称取 TET 5 mg，置于50 ml 量瓶中，加入流动相超声溶解，作为贮备液(100 μg·ml-1)。依次稀释制得浓度 0.25、0.5、1、5、10、、20、50 及 100 μg·ml-1系列标准溶液。以峰面积 (y)对浓度 (x，μg·ml-1)进行线性回归，回归方程为 y = 15.032x + 3.5045 (R2= 0.9998 )。在0.25～100 μg·ml-1内，样品浓度与峰面积呈良好线性关系。

4. 包封率和载药量的测定：将制得的 PLGA @TET NPs 溶液以 11500×g 离心 40 min 取上清，高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography，HPLC)测定 TET 的含量，包封率 (EE，%)= 纳米粒中 TET 的质量 / TET 的投药量×100%，载药量(DL，%)= 纳米粒中 TET 质量 / (纳米粒中 TET 质量 +PLGA 聚合物质量 )×100%。通过间接法测得包封率为 (85.34±0.12)%，载药量为 (7.86±0.01)%。

5. 载 PLGA @ TET NPs 表征：使用动态光散射(DLS)技术测量纳米粒的大小及 Zeta 电位。用透射电子显微镜 (transmission electron microscope，TEM )观察纳米粒形态。

6. 骨质疏松小鼠模型的构建：采用卵巢摘除术法构建骨质疏松小鼠模型。将模型小鼠分为 4 组(每组 8 只 )：假手术组，单纯卵巢切除组，去卵巢 +TET 组，去卵巢 + PLGA @ TET NPs 组。各治疗组尾静脉注射含同等剂量 TET 的 100 μl 磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS )，假手术组和单纯卵巢切除组尾静脉注射 100 μl 的 PBS。每周 1 次，连续 8 周。处理后各组小鼠予以戊巴比妥钠 0.04 mg / g麻醉，Micro-CT 检测骨小梁体积百分数 (percent trabecular bone volume / per tissue volume，BV / TV )，骨小梁数量 (trabecular number，Tb.N)及骨小梁分离度 (trabecular separation，Tb.Sp )，以评价小鼠骨质疏松程度。

7. 组织的 HE 染色：取不同组小鼠的脏器 (肝肾 )组织进行 HE 染色。简言之，用 4% 多聚甲醛固定液固定 24 h。送检进行苏木精 - 伊红染色。

8. 抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色：小鼠胫骨在 4% 多聚甲醛中固定 1 天，在 10% 乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)中脱钙 3 周。每份标本石蜡包埋，切成 10 μm 切片进行 TRAP 染色。用ImageJ 软件计算选定区域内的破骨细胞数。

四、统计学处理

结果

一、PLGA-TET 的制备与表征

本研究制备的 PLGA-TET NPs 的大小和电位总结在表1，值得注意的是，由于重复洗涤和离心后聚集程度不同，DLS 测量的粒径通常大于 TEM 估计的粒径。在透射电镜下 PLGA @ TET NPs 呈表面光滑的球形，与 PLGA NPs 在形态上没有明显的差异，结果见图1。采用 HPLC 法对 TET 进行了量化，测得包封率为 (85.34±0.12)%，载药量为 (7.86±0.01)%。

图1 a：PLGA NPs 的 TEM 图；b：PLGA @ TET NPs 的 TEM 图(1% 的磷钨酸负染 )Fig.1 a: TEM images of PLGA NPs; b: TEM images of PLGA @TET NPs (negatively stained with 1% phosphotungstic acid )

表1 NPs 的粒径、PDI 及 Zeta 电位结果 ( x-±s，n = 3 )Tab.1 Size, PDI and Zeta potential of NPs (±s, n = 3 )

表1 NPs 的粒径、PDI 及 Zeta 电位结果 ( x-±s，n = 3 )Tab.1 Size, PDI and Zeta potential of NPs (±s, n = 3 )

名称构成粒径 /nm多分散系数(PDI )Zeta 电位 /mv PLGA NPs裸 PLGA 纳米粒157.60±2.240.168±0.03-36.27±0.91 PLGA-TET NPs载 TET PLGA纳米粒235.70±9.830.281±0.13-24.34±0.92

二、对小鼠骨质疏松症的保护作用

笔者对骨质疏松小鼠的股骨进行了 Micro-CT 检测以评价小鼠骨质疏松程度。此外，笔者对肝、肾进行了 HE 染色，判断纳米粒是否会产生毒性效应导致组织损伤。然后进行 TRAP 染色，进一步确定TET 是否通过抑制体内破骨细胞生成来抑制骨质丢失。Micro-CT 结果显示，与单纯卵巢切除组相比，去卵巢 + TET 组及去卵巢 + PLGA @ TET NPs 组的BV / TV 及 Tb.N 均增加 (P＜0.01 )，而 Tb.Sp 降低(P＜0.01 )；并且去卵巢 + TET 组及去卵巢 + PLGA@ TET NPs 组的 Tb.N 差异有统计学意义 (P＜0.05 )(图2、3 )。HE 染色结果显示，各组肝、肾组织未见明显损伤 (图4 )。TRAP 染色实验中，药物治疗组小鼠的 TRAP 阳性细胞比去卵巢小鼠组减少，并且纳米粒组和 TET 组差异有统计学意义 (P＜0.05 )(图5、6 )，表明药物治疗组破骨细胞受到抑制，并且纳米粒组较游离 TET 组效果更好。

图2 Micro-CT 评价 PLGA @ TET NPs 对骨质疏松的治疗效果。Micro-CT 对股骨远端的三维重建图Fig.2 Evaluation of therapeutic effect of PLGA @ TET NPs on osteoporosis by Micro-CT. Three-dimensional reconstruction of the distal femur by Micro-CT

图3 对各组 BV / TV、Tb.N 及 Tb.Sp 的定量分析 (*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；#P＜0.0001；ns，差异无统计学意义 )Fig.3 Quantitative analysis of percent trabecular bone volume per tissue volume (BV / TV ), trabecular number (Tb.N ), and trabecular separation(Tb.Sp)in each group. (*P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001; #P＜0.0001; ns, no significant difference )

图4 获得主要器官切片并用 HE 染色 (10 倍镜下 )Fig.4 Sections of main organs were obtained and stained with HE (× 10 )

图5 TRAP 染色胫骨图片 (10 倍镜下 )Fig.5 Photographs of tibias with TRAP staining (× 10 )

图6 TRAP 阳性细胞数量的定量分析 (*P＜0.05；ns，差异无统计学意义 )Fig.6 Quantitative analysis of TRAP-positive cell numbers (*P ＜0.05; ns, no significant difference )

讨论

本研究中，笔者发现纳米粒携带的 TET (PLGA@ TET NPs)在体外能抑制破骨细胞的生成，以前的研究更多集中在游离 TET 在关节炎中的作用。本研究首次验证了纳米粒携带的 TET 对去卵巢小鼠骨质疏松症的治疗作用。骨质疏松症是一种常见的与年龄相关的代谢性疾病，在老年人尤其是绝经后妇女中发病率很高[21]。随着人口老龄化，骨质疏松症已成为全球性的健康问题。据估计，约有 2 亿人受到不同程度的骨质疏松症的影响。因此，这一现象不仅产生了社会经济影响，增加了与骨质疏松症相关的医疗保健费用，而且给骨质疏松症患者及其家人带来了沉重的负担[22-23]。

许多从中药中提取的单体对破骨细胞的生成有抑制作用。TET 是一种双苄基异喹啉生物碱，临床上已广泛应用于类风湿性关节炎的治疗。近来有学者发现 TET 可以显著预防卵巢切除术引起的骨质流失并抑制 RANKL 诱导的破骨细胞生成[16]。此外，也有学者研究了 TET 可以通过抑制 p65 磷酸化来减轻去卵巢骨质疏松的软骨退变。因此，笔者推测TET 可以用于治疗骨质疏松症。但由于它的水溶性差，临床应用受到限制。PLGA 是 FDA 批准的共聚物之一，由乳酸和乙醇酸组成，是众所周知的药物递送系统，它可以弥补 TET 水溶性差的问题。笔者采用纳米沉淀法制备了 PLGA @ TET NPs。其制备的纳米粒粒径约为 236 nm，表面带负电荷。纳米粒具有良好的稳定性、生物相容性和对 TET 的高包封性和载药量。

目前，采用双侧卵巢切除术法构建骨质疏松症小鼠模型是用于模拟绝经后骨质疏松症发病机制最常用的模型。因此笔者将 12 周龄的雌性 C57BL / 6小鼠去卵巢模拟骨质疏松症模型，建模 2 个月后分别按照实验计划施加不同的治疗方案。本研究采用Micro-CT 扫描小鼠股骨发现，载药纳米粒组可以改善骨质疏松程度；HE 染色法验证了该给药系统是否具有毒性，各组间比较，肝肾未见明显损害，说明在本研究中，该纳米粒给药系统没有明显毒性。此外，TRAP 染色结果发现，载药纳米粒组能抑制模型小鼠破骨细胞活性的升高。这些结果表明，载药纳米粒组可以有效地用于骨质疏松症的治疗。当然，本研究还存在许多缺陷，首先没有设置纳米粒组探讨其是否对成骨作用有影响；其次，本研究只做了动物实验，没有做细胞实验来进一步验证。以上缺陷是接下来研究的方向。

综上所述，本研究采用纳米沉淀法制备了携带 TET 的递送系统，可以弥补 TET 水溶性不足的问题，该纳米粒具有较强的稳定性、良好的生物相容性以及较高的包封率和载药量。值得一提的是，该纳米粒可通过抑制破骨细胞生成，改善骨质疏松程度，从而减轻小鼠的骨质流失。总之，本研究为骨质疏松症的治疗提供了一个新思路。