microRNA 在骨不连研究中的新进展

吕利军 常艳艳 李闯兵 刘鹏 张凯 高秋明

骨不连是四肢骨折术后常见并发症，治疗棘手，目前仍是全世界骨科医师临床工作中所面临的难点与挑战。虽然骨不连的治疗方法较多，但其发病率仍高达 5%～10%[1]，不但给患者及家属带来极大的痛苦，而且增加医疗开支。微小核糖核酸 (microRNA，miRNA)是非编码的单链小分子 RNA，能够靶向结合 mRNA 的 3’-非翻译区，使靶基因发生转录后沉默，进而在细胞的分化、增值、凋亡等方面进行调控[2]。microRNA 具有多靶性，即一个 microRNA 可以针对多个靶基因的表达发挥作用，并且一个靶基因能够接受多个 microRNA 分子的调控[3]。microRNA 通过炎症反应、血管生成、诱导成骨及细胞自噬等过程，在骨不连的发生、发展过程中起调节作用。骨不连的发生过程受到多种 microRNA 调控特定靶基因的表达，至目前为止，未有对骨不连中 microRNA 对靶基因调控机制进行具体分析总结，因此，笔者就骨不连中microRNA 对靶基因调控机制的相关性进行综述，为研究骨不连的分子机制提供理论依据，同时也为进一步研究microRNA 对骨不连的调控机制提供理论基础。

一、microRNA (miRNA)的生物学特征

microRNA (miRNA)是调节基因表达的单链非编码小分子 RNA，长度为 21～25 核苷酸构成，microRNA 的前体位于高度保守的基因组非编码区，这些区域已知在发育和分化中起关键作用[4]。miRNA 广泛表达，同时具有组织特异性。microRNA 通过与信使 RNA (mRNA)的 3’-非翻译区 (3’-UTR)结合来减少翻译或者增加转录本的降解，或通过与完全互补的相关 mRNA 配对诱导 mRNA 切割，过表达或者下调靶基因从而发挥基因表达的调节作用[5]。因此，microRNA 几乎在所有细胞信号传导通路中发挥调节作用，并且已证明它们的失调在骨不连的发生发展中具有重要作用。在这一系列过程中，上调 microRNA 会导致骨不连的发生，而下调 microRNA 会促进骨不连成骨细胞的增加，二者通过调节靶向相同或者不同的分子而参与致病途径，可能促进骨不连或者骨愈合的发生和发展。

二、骨不连中的上调或者下调 microRNA

microRNA 有助于调节成骨细胞、软骨细胞和破骨细胞的增殖与分化，microRNA 在骨形成、再吸收、重塑和修复中具有重要作用，此外，已证实 microRNA 参与骨折愈合和骨不连，炎症反应的不平衡、成骨细胞和软骨细胞的增殖和分化减少以及血管形成的功能降低和改变被认为是骨折愈合受损的可能致病机制。因此，microRNA 的上调或者下调均会导致骨不连疾病的发展过程。

1. 骨不连中的上调 microRNA：miR-31a-5 是老年骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs )中一种高表达的 microRNA，在骨不连中发挥着调节作用，其在骨不连中显著上调。研究发现，来自老年大鼠的骨髓间充质干细胞表现出成骨减少和衰老表型增加，这与miR-31a-5p 的上调有关[6]。最近有研究证明 miR-31a-5p 的上调可以下调靶基因 SATB2、Runt 相关转录因子 2 和骨形态发生蛋白受体 2 的表达 ，并表明抑制 miR-31a-5p 活性可促进 MSCs 在体外的成骨分化[7]。miR-31a-5p 随着 BMSCs的衰老而显著增加，并通过外泌体分泌到细胞外微环境中，然后，使用外泌体作为载体的功能，miR-31a-5p 通过RhoA 途径正向调节破骨细胞分化[8]。此外，将 miR-31a-5p应用到骨髓中可减少与年龄相关的骨质流失，这表明它可能是治疗与年龄相关的骨不连的潜在生物疗法。

miR-381 在骨不连中高表达，抑制成骨细胞合成，导致骨折延迟愈合。miR-381 通过与 WNT5A 和 FZD3 的3’-UTR 结合，从而抑制它们的表达并进一步影响 BMSC 成骨分化[9]。miR-381 表达上调并与 Wnt 信号通路相关。Wnt信号在 BMSC 成骨过程中受到抑制，同时 PPARγ 蛋白上调。miR-381 过表达通过靶向 Wnt5A 和 FZD3 (Wnt 信号传导中的两个重要因子)抑制成骨分化，从而抑制 β-catenin核易位。miR-381 过表达显著降低了成骨标志物 Runx2、ALP 和胶原蛋白 Ⅰ 的蛋白质水平，同时增加了 PPARγ 的蛋白质水平，PPARγ 是一种促进脂肪生成和抑制成骨的转录因子[10]。mmu-miR-140-3p 和 mmu-miR-140-5p 在小鼠骨不连模型中处于高表达状态，其上调可引起骨不连发生，具体发生机制是 mmu-miR-140-3p 和 mmu-miR-140-5p 负调节核因子-κB (NF-κB)的炎症信号传导，下调炎症反应而导致愈合受损，通过下调 SDF-1α 对 BMP-2 具有间接抑制作用，从而导致骨不连发生[11]。

2. 骨不连中的下调 microRNA：据文献报道，miR-92a下调能够通过血管生成作用促进骨不连再生[12]，miR-20a、miR-29b、miR-2861、miR-138、miR-26a、and miR-21 等均具有促进成骨再生作用，miR-193a-3p 可能在骨不连中下调，使上调靶基因 MAPK10 的表达[13]。hsa-microRNA(miR)-1225-5p-CCNL2、hsa-miR-339-5p-PRCP 和 hsa-miR-193a-3p-丝裂原活化蛋白激酶 10 (MAPK10)是三对与基因表达水平降低相关的 microRNA。hsa-miR-193a-3p 被证明通过靶向 MAPK10 诱导 BN。下调的差异表达基因主要与“ECM-受体相互作用”、“黏着斑”和“钙信号通路”等途径相关[14]。hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-339-5p 和hsa-miR-193-3p 及其各自的靶基因 CCNL2、PRCP 和MAPK10 作为对骨不连诊断的潜在生物标志物，促进成骨细胞的增殖、分化和迁移[15]。

三、microRNA 在骨不连中的机制

近年来多项研究发现 microRNA 能够调节特点靶基因的表达，从而对骨不连发展过程中的炎性反应、细胞增殖、血管新生及成骨细胞分化、细胞自噬等过程产生影响，笔者就 microRNA 促进靶基因调控介导骨不连的作用机制进行详细阐述见图1。

图1 骨不连主要 microRNA 生物学表型及靶基因调控分子 FGF-2示成纤维细胞生长因子 2；BMP-2 示骨形态发生蛋白-2；TGF-β 示转化生长因子-β；TGF-α 示肿瘤坏死因子-α；IL-1 示白细胞介素-1；VEGF 示血管内皮生长因子；RUNX2 示 RUNT 相关转录因子 2Fig.1 Biological phenotype of main microRNA in nonunion and target gene regulatory molecule FGF-2 shows fibroblast growth factor 2; BMP-2 shows bone morphogenetic protein-2; TGF-β indicates transforming growth factor-β; TGF-α shows tumor necrosis factor-α;IL-1 shows interleukin-1; VEGF shows vascular endothelial growth factor; RUNX2 shows RUNT-related transcription factor 2

表2 骨不连相关下调 microRNATab.2 Nonunion-related down-regulation of microRNA

1. 炎性反应 microRNA 启动炎性反应并调控骨痂重塑：microRNA 通过炎性反应来影响骨折愈合过程中骨不连的发生发展。一项研究表明对于糖尿病的大鼠横型骨折模型发现 miR-181a-1-3p 通过靶向降低 IL-1α 的表达，炎性反应失调而导致骨折愈合延迟和骨不连发生[16]。研究结果表明巨噬细胞的极化障碍导致骨髓间充质干细胞中核转录因子-κB 活性升高，抑制成骨分化[17]。miR-31a-5p、miR-146a-5p、miR-146b-5p 和 miR-223-3p 参与了炎症反应的调节，miR-146a-5p 和 miR-146b-5p 通过靶向抑制 TNF 受体相关因子 6 和白细胞介素 (IL)-1 受体相关激酶来损害NF-κB 信号传导，因此抑制 TNF-α 和 IL-1。20miR-223-3p靶向信号转导和转录激活因子 3 以负调节 IL-1 和 IL-6 的表达[18]。总之，miRNA 可能在骨不连的发展中发挥重要作用，因为它们在调节炎症方面发挥重要作用。miR-140-3p通过调节核受体共激活因子 1 (NCOA1)和核受体相互作用蛋白 1 (NRIP1)的表达来负调节核因子-κB (NF-κB)炎症信号传导。miR-451a 通过 14-3-3ζ 和 Rab5a 抑制 p38 丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)的磷酸化来减轻炎症[5]。促炎细胞因子，如 TNF-α 和 IL-1α 能够激活 p38 MAPK。此外，p38 MAPK 的激活和信号传导也导致这些炎性细胞因子的产生及其信号转导[19]。p38 MAPK 和促炎细胞因子之间的相互作用对于控制成骨细胞和软骨细胞中的生死信号级联反应很重要[20]。总之，miR-140-3p、miR-181a-5p 和miR-451a 可能通过调节炎症在骨折愈合过程中发挥重要作用。然而，mRNA 水平不能代表炎性因子的蛋白水平，探索炎性分子的蛋白水平才能从炎症反应角度为骨不连的治疗提供依据。

2. 血管再生 microRNA 为骨愈合营养供给提供通道：充分的血液供应为骨折愈合提供氧气、离子、能量并运载炎性细胞及成骨相关因子，若骨折愈合过程中血管营养供给通道未建立，则会导致骨折延迟愈合甚至骨不连发生。VEGF 通过 PI3K / Akt、Notch 等信号通路促进血管内皮的增殖，从而调控血管内皮的重建与再生。外泌体可以作为载体在不同细胞之间转移蛋白质、mRNAs 和microRNAs，受体细胞的基因表达和蛋白质翻译可以通过递送物质而改变[12]。Zhang 等[21]进行大鼠骨不连模型实验，证实骨髓间充质干细胞外泌体的移植能够促进成骨和血管生成，对骨不连的治疗发挥关键作用，这种促进作用可能归因于 BMP-2 / Smad1 / RUNX2 和 HIF-1α / VEGF信号通路的激活，其 RUNX2 是骨形成的关键因素。MicroRNA-210 (miR-210)是关键的缺氧相关 miRNA，研究表明，这种 miRNA 通过靶向 Ephrin-A3、E2F3、NPTX1、RAD52、ACVR1B、MNT 和 CASP8AP2 等参与血管生成、调节细胞增殖与分化、脱氧核糖核酸修复和细胞凋亡[22]。Lu 等[23]研究 microRNA-210 (miR-210)在氧 - 葡萄糖剥夺条件下对内皮祖细胞的影响，结果表明miR-210-3p 的上调增强了内皮祖细胞在氧 - 葡萄糖剥夺条件下的血管生成能力，相反，下调 miR-210-3p 抑制了这些过程。Takahara 等[16]对大鼠闭合性股骨骨折研究发现miR-210-3p 在骨折愈合后期表达下降，考虑与血管生成减少有关，从而引起骨折延迟愈合甚至骨不连出现。因此，骨髓间充质干细胞外泌体、microRNA-210、miR-210-3p 均能够促进血管再生，从而促进骨折愈合，为治疗骨不连提供新的思路。

3. microRNA 在成骨或者软骨细胞分化中的作用：成骨或者软骨细胞分化、血管形成是骨折愈合的主要过程，骨细胞受损或者血管形成障碍均会引起骨折不愈合甚至发生骨不连。Luzi 等[24]证实 miR-196a 调节人脂肪组织来源的间充质干细胞的增殖和成骨分化，而不影响脂肪形成分化。Serpin 家族 B 成员 2 (SerpinB2)是丝氨酸蛋白酶抑制剂 (serpins)B 亚群的成员。SerpinB2 是胎盘组织来源的尿激酶纤溶酶原激活物 (uPA)抑制剂，也称为纤溶酶原激活物抑制剂 2 型 (PAI-2 )，SerpinB2 是一种 TGFβ 反应基因。一项研究表明敲除 SerpinB2 基因能够促进骨髓间充质干细胞的成骨分化潜能，这表明 SerpinB2 基因可能在成骨过程中起重要作用[25]。SerpinB2 基因沉默通过 Wnt /β-catenin 信号通路促进 hBMSCs 的成骨分化，体内沉默SerpinB2 基因有效促进骨折愈合，提示 SerpinB2 可能是骨折愈合的新靶点。Runx2 是 BMSCs 成骨分化的主要转录因子，可抑制脂肪细胞分化。Runx2 主要受 Wnt / β-catenin信号通路的调节，也称为经典 Wnt 通路，是 Wnt 信号通路的三大分支之一，β-连环蛋白是 Wnt / β-连环蛋白通路的重要组成部分，是寻找治疗药物的中心目标[26]。Wei等[27]对萎缩性骨不连模型通过生物信息学分析、miRNA和 mRNA 的 qRT-PCR、蛋白质印迹以及荧光素酶检测证实上调 hsa-miR-149、hsa-miR-221、has-miR-628-3p 和hsa-miR-654-5p 可以下调靶基因碱性磷酸酶 (ALPL )、血小板衍生生长因子亚基 A (PDGFA)和 BMP2 的表达，从而抑制成骨细胞的合成。BMPs 是属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族的多功能生长和分化因子，TGF-β 通过影响骨形成成骨细胞和骨吸收破骨细胞的分化和活性而在骨重塑中发挥作用。

4. microRNA 在细胞增殖与自噬中的作用：细胞增殖是骨重建的基石，而细胞自噬是骨愈合的重要伴侣，自噬是将受损的细胞器与错误折叠的蛋白质在利用的过程，增殖与自噬二者是有机统一的，均促进骨折愈合。软骨细胞特异性 miR-140 miRNA 是小鼠正常软骨内骨生长所必需的，miR-140 缺乏会导致侏儒症和颅面畸形，miR140-5p的靶基因是 Wnt11，Wnt11 的 3’-非翻译区中预测的miR140-5p 结合位点的破坏表明会增加 Wnt11 mRNA 的表达并使骨骺发育的速度加快[28]。硫酸钙骨移植物其多孔结构有助于细胞增殖，机制是多孔结构为液体的流动提供空间，产生流体剪切力而促进骨愈合。据报道[29-30]，流体剪切力通过 miR-140-5p / EGFA / ERK5 通路以及 NFATc1 /ERK5 通路促进成骨细胞的增殖。骨折后局部形成血肿，局部组织缺氧，炎症反应激活自噬系统，从而促进骨折愈合。雷帕霉素激活自噬系统后，成骨分化因子表达会升高，比如 RUNX2、骨钙素、骨桥蛋白，茜素红染色及碱性磷酸酶染色结果显示成骨分化水平升高，新生骨的体积增加[31]。相反，3-甲基腺嘌呤 (3-methyladenine，3-MA )是自噬抑制剂，导致上述表达因子降低，从而抑制成骨细胞的分化[32]。目前，对于自噬与增殖为靶点治疗骨不连的方式较少，有必要进一步研究增殖与自噬对骨愈合及骨不连的具体调控机制及临床应用。

四、microRNA 作为骨不连分子诊断与治疗靶点的潜在价值

目前临床上对于骨不连的诊断主要靠影像学检查，其中 X 线与 CT 检查是最常用的检查方法，但仍存在许多局限性，比如对于感染性骨不连的诊断因细菌低毒力以及阳性率较低，急需一种敏感性与特异性强的方法去诊断。临床上检测 microRNA 的方法有 qRT-PCR、microRNA 芯片技术、蛋白质印迹以及荧光素酶检测。据文献报道，miRNA-331-3p 和成纤维细胞生长因子 23 (FGF23)指标能够用于诊断感染骨不连，miRNA-331-3p 生物标志物被证明通过靶向 FGF23 来调节成骨细胞矿化，该指标作为感染性骨不连和其它炎症性骨病的潜在诊断生物标志物和治疗靶点[13]。MicroRNA-26a (miR-26a)在骨代谢中起关键作用，Sun 等[33]使用 Wb、qRT-PCR 技术检测骨不连发病情况，发现 miR-26a 升高是骨不连预后不良的可靠指标。对于骨不连的治疗目前临床上主要包括骨移植、外泌体介导的干细胞治疗、低强度脉冲超声波疗法、Ilizarov 技术以及 Masquelet 技术等，但随着 microRNA 在骨不连中的作用被发现，microRNA 的靶向治疗也在实验中证明具有可行性与有效性，为临床治疗骨不连提供了思路。研究发现，外泌体 miR-144-5p 在骨再生中的重要作用，可以作为治疗骨不连的潜在靶点[34]。Wu 等[35]发现 miR-1260a 在骨髓间充质干细胞外泌体 Fe3O4 中高表达，并且外泌体miR-1260a 通过抑制 HDAC7 和 COL4A2 的表达来增强骨髓间充质干细胞的成骨分化和血管生成。microRNA 靶点的治疗目前仍处于基础实验阶段，比如中药淫羊苷通过调控 microRNA，促进成骨细胞表达，抑制破骨细胞，用于治疗骨不连[36]，microRNA 用于临床治疗骨不连的相关报道仍然较少，需要进一步研究。

五、总结与展望

microRNA 在骨不连中通过调控相关靶基因和信号通路，参与骨不连细胞的增殖、自噬、成骨、血管再生以及炎性反应，并且作为骨不连临床辅助诊断和预后预测的潜在生物学标志，具有骨不连临床靶点治疗的潜力，有着重要的临床价值和应用前景。虽然 microRNA 在骨不连中的价值逐渐被人们所发现和重视，但临床中仍有许多问题和挑战有待进一步去解决，比如在众多与骨不连相关的 microRNA 以及靶基因中，如何判断那个 microRNA在骨愈合的哪个阶段具有代表性，单个的 microRNA 可以调控多个靶基因或者单个靶基因被 microRNA 所调控，还需要继续探索与实验，这都是急需解决的问题。因此，microRNA 在骨不连中的分子机制仍需继续探索，需要投入大量的实验技术去突破，在诊断、预后、靶向治疗方面需要更多、更细、更深入的研究。