蛋白激酶在Cx40、Cx43调节缺氧处理大鼠肠系膜上动脉收缩反应性中的作用*

明 佳,李 涛,徐 竞,杨光明,张 瑗,刘良明

（第三军医大学大坪医院野战外科研究所第二研究室/创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆400042）

血管内皮细胞（vascular endothelium cell,VEC）是衬覆于血管腔面的单层鳞状上皮细胞,它除了具有屏障功能和参与物质交换的功能外,还具有活跃的代谢和内分泌功能,特别是它合成、释放的血管舒张和收缩因子,与神经、体液因子一起,共同参与了全身血管张力的维持和调节。缝隙连接是存在于相邻细胞间的一种膜通道结构[1],VEC和血管平滑肌细胞间存在着缝隙连接,即肌-内皮缝隙连接（myo-endothelial gap junction,M EGJ）,M EGJ可以穿过血管内弹力层,使VEC和血管平滑肌细胞进行双向性的、直接的电化学交流[2-3],参与了血管紧张性的调节。缝隙连接的基本组成单位是连接蛋白（connexin,Cx）,VEC同时表达Cx37、Cx40和Cx43[4]；血管平滑肌细胞协同表达Cx37、Cx40、Cx43和Cx45[4]。

严重休克失代偿期常出现血管低反应性,其主要表现为全身血管对舒/缩血管物质的反应减弱或不反应,目前对其发生机制尚不完全清楚。本研究的前期研究发现,Cx40、Cx43通过cAM P-PKA、cGMP-PKG、DG-PKC信号通路参与了休克后内膜依赖的血管收缩反应性的调节[5]。具体表现在：Cx40可以增加血管cAMP、cGMP的浓度和蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKG）的活性,降低二酰甘油（DG）的浓度、蛋白激酶C（PKC）的活性和血管内膜依赖的收缩反应性；Cx43可以降低血管cAM P、cGMP的浓度和PKA、PKG的活性,增加DG的浓度、PKC的活性和血管内膜依赖的收缩反应性。但是，Cx40/43是如何通过PKA、PKG、PKC参与了血管钙敏感性和收缩反应性的调节目前尚不清楚,也未见相关的文献报道。本实验模拟休克缺氧损害,以SD大鼠的肠系膜上动脉（superior mesenteric artery,SMA）为研究对象,以Cx40/43的反义寡脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,AODN）阻断SMA的Cx40/43表达,在此基础上观察PKA、PKG、PKC的特异性激动剂和拮抗剂对不同程度缺氧SMA的肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase,MLCK）、肌球蛋白轻链磷酸酶（myosin light chain phosphotase,M LCP）活性和内膜依赖的收缩反应性的影响,希望通过本研究探索M EGJ调节失血性休克后血管收缩反应性的可能机制。

1 材料与方法

1.1 标本的制备 Sprague Dawley大鼠[SD大鼠,体质量（270±10）g,雌雄不限]购于第三军医大学大坪医院野战外科研究所动物中心。主要药品：8-Br-cAMP、8-Br-cGMP、PM A、H-89、KT-5823、staurosporine、杨梅黄酮（myricetin）、乙酰胆碱（acetylcholine,Ach）均购自美国Sigma公司。主要仪器：恒温离体器官灌流浴槽购自西班牙Leitca Scientific Instruments公司,肌张力换能器及八道生理记录仪购自澳大利亚AD Instrument公司。

按照文献[6]的方法,无菌条件下取正常 SD大鼠的SM A,制成SMA血管环,随机分为常氧组、缺氧1h组和缺氧3h组,每组又分为对照亚组、Cx40/43AODN处理亚组、Cx40/43AODN联合蛋白激酶激动剂处理亚组、Cx40/43AODN联合蛋白激酶抑制剂处理亚组,每组8根血管或血管环。蛋白激酶激动剂分别为8-Br-cAMP（10-6mol/L,PKA激动剂）、8-Br-cGMP（10-4mol/L,PKG激动剂）、PMA（10-7mol/L,PKC激动剂）；蛋白激酶抑制剂分别为 H-89（10-6mol/L,PKA抑制剂）、KT-5823（10-6mol/L,PKG抑制剂）、staurosporine（10-7nmol/L,PKC抑制剂）。

将SMA血管环进行Cx40/43AODN转染、不同程度缺氧[5]、分别与 PKA、PKG、PKC特异性激动剂或拮抗剂孵育10min后,检测血管对杨梅黄酮（myricetin,内膜依赖性的血管收缩剂[7],工作浓度10-4mol/L）的收缩反应；另一部分血管在与10-4mol/L的 myricetin孵育 30min后,用于 M LCP、MLKC活性的检测。

1.2 内膜依赖的血管收缩反应性的测定 将转染或未转染Cx40/43AODN、常氧或缺氧处理的 SMA环悬挂于注有Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液[8-9]的离体器官灌流浴槽中,支架与肌张力换能器相连,按文献[8-9]的方法37℃孵育2h,待张力曲线平稳后,分别加入 8-Br-cAMP（10-6mol/L）、8-Br-cGMP（10-4mol/L）、PM A（10-7mol/L）、H-89（10-6mol/L）、K T-5823（10-6mol/L）、staurosporine（10-7nmol/L）孵育 10min后,加入 myricetin（10-4mol/L）观察SM A收缩力的变化。血管收缩力（g/mg）=加myricetin后血管环收缩力的增加值（g）/血管环质量（mg）。为了检测血管内膜的完整性,以去甲肾上腺素（终浓度为10-6mol/L）诱导血管环收缩至稳定的平台期后,加入终浓度为10-6mol/L的二酰胆碱（Ach）,以血管环舒张程度（%）评价血管舒张反应性,舒张程度超过70%表示血管内膜完整[10],本实验用的血管环均在舒张程度大于75%的条件下进行。血管环舒张程度（%）=（加Ach后血管张力的下降幅度/加去甲肾上腺素后血管张力的上升幅度）×100%。

1.3 M LCP活性测定 按常规方法提取血管总蛋白,取10μ L蛋白加入240μ L蛋白稀释液（T ris-HCl 25mmol/L,乙二胺四乙酸（EDTA）0.1mmol/L,0.1%β-巯基乙醇）混匀,取40μ L加入10μ L磷酸化myosin,25℃反应15min；以5%三氯乙酸100μ L、5mg/mL牛血清清蛋白25μ L终止反应；13000×g离心3min；取100μ L反应混合液进行液闪计数测定cpm值。同时取10μ L磷酸化myosin测定cpm值,以从磷酸化Myosin脱去的iP表示M LCP活性。

1.4 M LCK活性测定 按常规方法提取血管总蛋白,取30μ L蛋白加入60μ L酶反应缓冲液（T ris-HCl 30mmol/L pH7.4,KCl 50mmol/L,MgCl21mmol/L,4-硝基苯磷酸二钠（PNPP）60mg/mL,PKA抑制剂0.2mg/mL,[γ-32P]-A TP 0.2mmol/L,CaCl21mmol/L,CaM 50μ g/mL,myosin 2mg/mL）,混匀,25℃反应3min；加5%三氯醋酸液10μ L终止反应；吸取20μ L反应液进行液闪计数测定cpm值。

1.5 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行数据统计,统计结果以±s表示,各组间均数比较行ANOVA方差分析和Post hoc检验（S-N-K/LSD）,自身均数比较行配对t检验,相关性分析采用Pearson correlation检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PKA、PKG、PKC对Cx40/43AODN调节缺氧血管内膜依赖的收缩反应性的影响 与常氧组的对照亚组比较,缺氧1h组血管对myricetin的收缩反应性明显升高；缺氧3h组则明显降低。Cx40AODN可以明显增加血管的收缩反应性；Cx43AODN可以明显降低血管的收缩反应性。8-Br-cAMP、8-BrcGMP和staurosporine可以部分或完全拮抗Cx40AODN的作用,增强Cx43AODN的作用,明显降低Cx40/43AODN处理血管的收缩反应性；H-89、KT-5823和PMA可以部分或完全拮抗Cx43AODN的作用,增强Cx40AODN的作用,明显增加Cx40/43AODN处理血管的收缩反应性（图1）。

图1 PKA、PKG、PKC对Cx40/43AODN调节缺氧血管收缩反应性的影响

2.2 PKA、PKG、PKC对Cx40/43AODN调节缺氧血管M LCP活性的影响 与常氧组的对照亚组比较,缺氧1h组M L-CP活性明显降低,缺氧3h组血管的M LCP活性明显升高。Cx40AODN可以明显降低血管的MLCP活性；Cx43AODN可以明显升高血管的MLCP活性。8-Br-cAM P、8-Br-cGMP和staurosporine可以部分或完全拮抗Cx40AODN的作用,加强Cx43AODN的作用,明显增加Cx40/43AODN处理血管的MLCP活性；H-89、KT-5823和PMA可以加强Cx40AODN的作用,拮抗Cx43AODN的作用,明显降低Cx40/43AODN处理血管的MLCP活性（图2）。

图2 PKA、PKG、PKC对Cx40/43AODN调节缺氧血管M LCP活性的影响

2.3 PKA、PKG、PKC对 Cx40/43AODN调节缺氧血管MLCK活性的影响 缺氧1h组血管的M LCK活性较常氧组的对照亚组明显升高（P＜0.01）,缺氧3h组M LCK活性明显降低,myricetin、Cx40/43AODN对各组血管M LCK活性无明显影响（图3）。

图3 Cx40/43AODN对缺氧处理血管M LCK活性的影响

3 讨论

严重休克失代偿期常出现血管低反应性,其主要表现为全身血管对舒/缩血管物质的反应减弱或不反应,目前认为其发生机制主要与血管平滑肌细胞膜上的肾上腺素能受体失敏、细胞膜超极化和血管平滑肌细胞对钙的敏感性降低等三大因素有关[11]。但是,应用一氧化氮合酶抑制剂（如L-硝基精氨酸甲酯）[12]、KATP抑制剂（如格列本脲）[13]、以及钙增敏剂（如血管紧张素-Ⅱ）[11]只能部分恢复而不能完全逆转休克血管的反应性。前期研究发现,VEC通过Cx40/43参与了休克血管MLCP活性和MLC20磷酸化水平的调节,进而参与了对失血性休克后SMA内膜依赖的收缩反应性的调节[6]。

本实验采用离体血管环研究发现,因缺氧时间不同,血管的MLCP活性和收缩反应性发生不同变化：缺氧1h的血管处于高收缩反应期,血管的MLCP活性降低；缺氧3h的血管处于收缩低反应期,血管的 M LCP活性增加。myricetin和Cx40AODN可以降低正常血管和缺氧血管的M LCP活性,增加内膜依赖的血管收缩反应性；Cx43AODN可以增加血管的MLCP活性,抑制血管内膜依赖的收缩反应性。有研究表明,肌球蛋白是一种由肌动蛋白激活的Mg2+-ATP酶,其分子由2条重链和4条轻链组成,2条重链的氨基酸末端分别含有一个ATP水解部位和一个肌动蛋白结合位点,4条轻链分别为2条调节轻链（20kD）和 2条必需轻链（17kD）,M LC20受MLCK/M LCP催化发生磷酸化/脱磷酸化。外界刺激通过形成Ca2+-钙调蛋白（calmodulin,CaM）复合物激活MLCK,后者可以磷酸化M LC20,导致平滑肌收缩,此为M LC20磷酸化的钙依赖性途径；外界刺激通过抑制MLCP的活性,使M LC20去磷酸化作用减弱而导致血管收缩的途径为非钙依赖性途径。本实验结果显示,myricetin、Cx40/43AODN对缺氧血管MLCK活性无明显影响,Cx40/43可能通过调节MLCP活性的非钙依赖途径调节休克后SMA内膜依赖的收缩反应性。

作者的前期研究发现,Cx40、Cx43通过 cAMP-PKA、cGMP-PKG、DG-PKC信号通路参与了休克后内膜依赖的血管收缩反应性的调节[7]。具体表现在：Cx40可以增加血管cAM P、cGMP的浓度和PKA、PKG的活性,降低DG的浓度、PKC的活性和血管内膜依赖的收缩反应性；Cx43可以降低血管cAMP、cGMP的浓度和PKA、PKG的活性,增加DG的浓度、PKC的活性和血管内膜依赖的收缩反应性。本研究发现，myricetin和Cx40/43AODN对M LCP和血管收缩反应性的作用受 PKA、PKG、PKC的调节,具体表现为 8-Br-cAMP、8-Br-cGM P和staurosporine可以明显增加Cx40/43AODN处理血管的M LCP活性,明显降低Cx40/43AODN处理血管的收缩反应性；用H-89、KT-5823和PMA拮抗PKA、PKG,激活PKC后可以明显降低Cx40/43AODN处理血管的MLCP活性,明显增加Cx40/43AODN处理血管的收缩反应性。说明Cx40抑制血管内膜依赖的收缩反应性与其降低PKC活性、增加PKA和PKG活性、进一步通过后者调节MLCP的活性有关；Cx43促进血管内膜依赖的收缩反应性的机制与其增加PKC活性、抑制PKA和PKG活性、进而调节MLCP的活性有关。

综上所述,Cx40/43可能通过PKA、PKG、PKC信号通路调节血管M LCP的活性,进而参与了休克血管钙敏感性和血管内膜依赖的收缩反应性的调节,但是Cx40/43调节PKA、PKG、PKC及M LCP的具体机制还有待进一步的深入研究。

[1]Parthasarathi K,Ichimura H,Monma E,et al.Connexin 43mediates spread of Ca2+dependent proinflammatory responses in lung capillaries[J].J Clin Invest 2006,116（8）：2193-2200.

[2]Sandow SL,Tare M,Coleman HA,et al.Involvement of myoendothelial gap junctions in the actions of endothelium-derived hyperpolarizing factor[J].Circ Res,2002,90（10）：1108-1113.

[3]Toyofuku T,Yubuki M,Etotsu K,et al.Intercellular calcium signaling via gap junction in connexin43transfected cells[J].J Biol Chem 1998,273（3）：1519-1528.

[4]Jacques AH,Pascal N,Paolo M.Contribution of connexins to the function of the vascular wall[J].Cardiovas Res，2004,62（2）：345-356.

[5]明佳,李涛,杨光明,等.Cx40、43调节缺氧处理大鼠肠系膜上动脉收缩反应性的信号途径[J].中国病理生理杂志,2009,25（7）：1262-1265.

[6]Ming J,Li T,Zhang Y,et al.Regulatory effects of MEGJ on vascular reactivity following hemorrhagic shock in rats [J].Shock,2009,31：80-86.

[7]Rosario J,Emile A,Juan D,et al.Involvement of thromboxane A2in the endothelium-dependent contractions induced by myricetin in rat isolated aorta[J].Br J Pharmacol,1999,127（7）：1539-1544.

[8]明佳,刘良明,李涛,等.肌-内皮缝隙连接对失血性休克大鼠血管收缩反应的影响[J].中华危重病急救医学，2006,18（9）：519-522.

[9]明佳,刘良明,李涛,等.肌-内皮缝隙连接对失血性休克大鼠血管舒张反应的影响[J].创伤外科杂志,2006,8（2）：120-123.

[10]Knapp J,Bokní k P,Linck B,et al.Cantharidin enhances norepinephrine-induced vasoconstriction in an endothelium-dependent fashionl[J].J Pharmacol Exp Ther,2000，294（2）：620-626.

[11]Xu J,Liu LM.The role of calcium desensitization in vascular hyporeactivity and its regulation following hemorrhagic shock in the rat[J].Shock,2005,23（6）：576-581.

[12]Liu LM,Ward JA,Dubick MA.Hemorrhagic shock induced vascular hyporeactivity to norepinephrine in select vasculatures of rats and the roles of nitric oxide and endothelin[J].Shock,2003,19（3）：208-214.

[13]Fukata Y,Aman M,Kaibuchi K.Rho/Rho-kinase pathway in smooth muscle contraction and cytoskeletal reorganization of non-muscle cell[J].Pharmcol Sci,2001,22（1）：33-39.