石墨炉原子吸收光谱分析法测定大鼠前列腺组织中的镉含量

曹显庆,逯岭松,谢国明△

（重庆医科大学：1.公共卫生学院；2.医学检验系 400016）

前列腺癌为老年男性常见恶性疾病之一,其发病率居全球男性癌症发病率的第3位,病死率居第6位[1]。镉（Cd）是一种有毒重金属,属于环境毒素,在人体内可蓄积50年左右,能对多种器官和组织造成损害,大量实验证实镉是前列腺致癌物[2-3]。前列腺癌组织中镉含量明显增高[4]。镉的检测需要一些敏感性比较高的分析技术,配对等离子体质谱法（ICP-MS）被用于镉的检测[5-6],然而,这种技术所需设备过于昂贵。用配对等离子体可见光谱法（ICP-OES）对镉进行测定,检测的敏感性不高,而且测定前必须进行预浓缩或预分离[7]。石墨炉原子吸收光谱分析法因其操作简单,检测的高度敏感性和专一性,是检测生物样本中低含量镉的最为普遍的方法。在过去的几年中,不同的化学修饰物被报道作为基体改进剂用于镉检测，NH4H2PO4是最传统的、应用最广泛的基体改进剂[8],用于反应中使分析物保持稳定并除去背景干扰。在被测定样品中加入具有针对性的基体改进剂,提高原子化温度,以确保在灰化阶段既能将干扰物质去除,又不损失被测物质。本文以1.0% HNO3+0.5%NH4H2PO4作为基体改进剂,用石墨炉原子吸收光谱分析法测定大鼠前列腺组织中的镉含量,对化学改进剂及其用量、石墨炉工作条件进行研究,现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器 日立Z-5000型原子分光光度计,配置THGA石墨炉、热解涂层平台石墨管、zeeman偏振效应背景校正器、AS-71自动进样器、镉空心阴极灯、millipore纯水机等。

1.2 试剂与溶液 HClO4（优级纯）、浓 HNO3（优级纯）、 NH4H2PO4（分析纯）、氯化镉溶液（分析纯）、生理盐水、Cd标准溶液1000μ g/mL（国家有色金属及电子材料分析测试中心GSB 04-1721-2004）,并用1%HNO3逐渐稀释成0、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0μ g/mL的溶液,以上所用试液均用超纯水配制。

1.3 样本来源 取健康成年大鼠20只,体质量190～230g,每只于前列腺内注射0.1%氯化镉（生理盐水配制）1次,剂量为2mg/kg体质量。

1.4 样品的初步处理 用超纯水多次洗涤后,将大鼠前列腺组织样品放入真空干燥箱中于90℃烘干2h备用。样品的消化：用分析天平准确称取烘干的组织样品,加入消化液（浓硝酸∶高氯酸=7∶3）后盖上表面皿,放在电炉上先小火加热至样品溶解,随后在电热板上将温度调至200℃,消化至液体由黄色变为无色,蒸发近干,用1.0%HNO3溶液溶解剩余残渣,定容备用。

1.5 检测原理 取待测样本,加入基体改进剂后,经石墨炉原子化器和zeeman偏振效应背景校正器进行原子化和背景校正,测定吸光度,通过标准曲线求得Cd含量。

1.6 石墨炉升温程序 石墨炉原子吸收测定过程包括干燥、灰化和原子化3个阶段,其中Cd的挥发和其他杂质的干扰易发生在灰化和原子化阶段。实验选择1.0%HNO3+0.5% NH4H2PO4作为基体改进剂,主要用于提高样品的灰化效率和Cd的原子化效率,见表1。

2 结果

2.1 标准曲线与回归方程 分别吸取Cd标准溶液1000μ g/mL,并用 1%HNO3逐渐稀释成 0、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0μ g/mL的溶液。在选定的试验条件下,测定样品的吸光度,仪器自动绘制标准曲线,见图1。可以看出,Cd标准溶液浓度在0.5～5.0μ g/mL范围内,与吸光度线性相关关系良好。回归方程为：Y=0.0561+0.0704X,r=0.9949。从回归方程可以看出,该方法的灵敏度高,线性关系好。

表1 石墨炉升温程序

2.2 方法的准确度 加标回收实验用3份样本分别加入20.00μ g/mL Cd的标准溶液进行测定,结果见表2。

表2 加标回收实验结果

2.3 方法的精密度 将初步处理的样本按制备标准曲线的条件随机抽取5个试样,进行3次测定,RSD值均小于5%,在允许范围内,所得结果见表3。

表3 精密度实验结果

图1 标准曲线

3 讨论

3.1 样品最佳消化方法的选择 用不同的混合酸对样品进行消解处理。结果表明,采用浓硫酸易使样品碳化,使消解不完全；而使用过氧化氢和硝酸、硝酸和盐酸以不同比例混合较费时,且有时消解不完全。当使用浓硝酸与高氯酸混合时,消解效果最好,并且实验中发现当浓硝酸和高氯酸以7∶3比例混合时,样品消解时间最短,消解最完全,对各种类型的组织样品均有较好的消化效果。

3.2 基体改进剂的选择 基于大鼠前列腺组织中基体成分复杂,直接测定需将灰化温度提高以降低背景干扰,而Cd的沸点较低（767℃）,是易挥发元素,当无基体改进剂时,温度超过200℃时就会在石墨喷雾器处挥发,使测定结果不准确。通过添加基体改进剂的方法进行改进,基体改进剂主要是用来改善石墨炉原子吸收中待测元素的热稳定性,允许灰化阶段采用更高的灰化温度,保证待测元素原子化前没有损失,从而提高测定结果的准确性。文献[7]提出用PdCl2-M g（NO3）2作基体改进剂,灰化温度可达600℃左右,但实际操作步骤繁琐,预处理时间长,所用试剂量大,容易造成试剂污染和待测物质的损失。本实验用1.0%HNO3+0.5%NH4H2PO4作为基体改进剂,可提高灰化温度至650℃,防止镉的挥发,即使在灰化阶段采取较高的温度也可保持稳定。此外,大鼠前列腺组织的成分比较复杂,用石墨炉原子吸收光谱分析法检测时,基体中的其他物质易产生干扰,文献[9]用NH4NO3-Pd（NO3）2联合基体改进剂直接检测海水中的痕量Cd,当加入NH4NO3-Pb（NO3）2时能够对海水的基体干扰起到很好的抑制作用,但是在绘制标准曲线时出现的峰形不好；使用Mg（NO3）2作为基体改进剂测定Cd标准样品时的响应信号稳定,但是用这种基体改进剂测定大鼠前列腺组织样本时所得到的响应信号较差。本实验还加入适当浓度的HNO3用于分解大鼠前列腺组织中的有机物,能将氯化物转化成易挥发的硝酸盐和氯化氢,考虑到高浓度的HNO3会减短石墨管的寿命,本实验将HNO3的浓度设定为1.0%。经反复实验后发现,在大鼠前列腺组织Cd含量检测中使用该基体改进剂效果显著,1.0%HNO3+0.5% NH4H2PO4可有效地降低背景吸收,并且不需要复杂的化学前处理,从而达到直接测定的目的。本实验结果显示,使用1.0%HNO3+0.5%NH4H2PO4作为基体改进剂时,有利于有效地分离背景吸收信号和原子吸收信号,提高原子化效率,Cd的吸光度明显增强。

本文通过使用添加了1.0%HNO3+0.5%NH4H2PO4基体改进剂的石墨炉原子吸收光谱分析法测定大鼠前列腺组织中的Cd含量,具有良好的准确度与精密度,并且简单,快速,是一种理想的检测镉的方法。使用该方法可用于研究大鼠前列腺组织镉含量与前列腺癌进展的相互关系,在临床诊断前列腺癌、生物医学、化学毒物分析方面有很好的应用前景。

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