参附注射液对人慢性髓性白血病细胞来源的树突状细胞诱导生成的影响

任莉莉，问 明，杨 华，臧爱民，贾友超，魏影非

(1河北大学附属医院，河北保定071000;2河北医科大学第三医院)

近年来，有关树突状细胞(DCs)参与肿瘤特异性主动免疫效应与机制的研究十分活跃。研究发现用内源的方法可将白血病细胞诱导分化成为DCs，但是却只能使一部分白血病细胞分化为DCs。而目前中药与白血病细胞来源的成熟DCs的关系引起越来越多学者的关注。2008年10月～2009年10月本实验观察了粒—巨噬细胞集落因子(GMCSF)/白细胞介素4(IL-4)、不同浓度参附注射液(SFI)及不同浓度SFI联合GM-CSF/IL-4不同组合诱导K-562细胞分化为DCs的影响，并通过比较来研究探讨SFI的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 重组人GM-CSF由华北制药金坦公司惠赠;重组人IL-4为美国Pepprotech公司产品，比活性13 U/ng;异硫氰酸荧光素(FITC)-CD1a单抗、FITC-CD80单抗、藻红朊荧光素(PE)-CD83单抗、PE-HLA-DR单抗为美国B-D公司产品;人IL-12试剂盒为上海森雄科技实业有限公司产品(进口分装);噻唑兰(MTT)购于Ameresco公司。SFI由雅安三九药业有限公司提供，批号:030907;K-562细胞由河北医科大学细胞生物研究室惠赠。洁净工作台(苏州净化设备厂)，恒温CO2细胞培养箱(美国SHELDON公司)，低速离心机(日本KUBOTA)，倒置显微镜(日本Olympus公司)，流式细胞仪(Vantage，美国B-D公司)，酶标仪(北京Bintag公司)。

1.2 方法

1.2.1 体外诱导K-562 DCs DCs的培养和测定参照 Choudhury等［1］和王俊祥等［2］的方法，并加以改良。取生长良好的K-562细胞(调节细胞浓度为5×104个/ml)，选用IL-4(终浓度为50 ng/ml)+GMCSF(终浓度为100 ng/ml)、不同浓度的SFI(低浓度9.38 mg/ml，中浓度 37.5、75 mg/ml，高浓度 150、300 mg/ml)及IL-4+GM-CSF联合不同浓度的SFI(浓度分别同上)3种不同组合于37℃、5%CO2条件下诱导培养K-562细胞，倒置显微镜下观察细胞生长的动态变化。

1.2.2 DCs的流式细胞术分析 收集培养12～14 d的细胞，800 r/min离心10 min，取上清－20℃冻存留测细胞因子，细胞用PBS洗2次，调整细胞数为 1×106/ml，分别加入抗 FITC-CD1a、抗 FITCCD80、抗 PE-CD83和抗 PE-HLA-DR单克隆抗体，置暗处室温下反应15 min，上机检测。

1.2.3 DCs刺激同种混和淋巴细胞反应 取培养的细胞，加入丝裂霉素25 μg/ml，37 ℃、5%CO2孵育处理30 min，PBS洗3次作为刺激细胞。分离健康人外周血单个核细胞，贴壁2 h去除贴壁细胞，作为效应细胞。将刺激细胞与效应细胞按1∶2、1∶10、1∶50 比例加入96孔培养板，总体积200 μl。同时设一空白对照，只加入淋巴细胞。在37℃、5%CO2培养箱中培养72 h后，终止培养前4 h加入四唑盐(MTT，5 mg/ml，每孔20 μl)，在酶标仪上570 nm 检测 A 值。刺激指数(SI)=实验孔A值/空白对照孔A值。

1.2.4 IL-12 测定 取上述冻存的上清，采用ELISA法测定IL-12的含量，具体方法参照上海森雄科技实业有限公司的ELISA检测试剂盒说明书。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件包进行统计处理，多组均数间比较采用单因素方差分析;两两比较采用SNK-q法检验;采用直线相关分析T细胞增殖反应与DCs数量的相关关系。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 形态观察 倒置显微镜下可见K-562细胞呈球形，悬浮生长，加入GM-CSF/IL-4培养后，细胞体积增大并增殖，培养14 d左右时可见较多具有树突状突起的细胞。单独应用不同浓度SFI培养的K-562细胞可见，高浓度SFI处理孔中，300 mg/ml组细胞破碎死亡，150 mg/ml组增殖缓慢;中、低浓度SFI处理孔中细胞体积增大并增殖，但培养至第14天均未见具有树突状突起的细胞。而不同浓度SFI联合GM-CSF/IL-4诱导培养的K-562细胞可见，高浓度SFI处理孔中细胞破碎死亡或体积稍增大，但增殖缓慢，且树突状突起的细胞少见;中、低浓度SFI处理孔中细胞体积增大并增殖，培养10～12 d时具有树突状突起的细胞比例明显增加，与其他组细胞相比，细胞生长良好。其中终浓度为75 mg/ml SFI处理孔中的细胞增殖和成活率均达到最佳，因此SFI组只选择加入终浓度为75 mg/ml SFI组的细胞做细胞表型分析、同种混合淋巴细胞反应测定及IL-12分泌水平的测定。

2.2 细胞表型变化 见表1。

表1 SFI对K-562 DCs细胞免疫表达的影响(%)

2.3 DCs刺激同种异体T细胞增殖的能力 见表2。K-562细胞和75 mg/ml SFI组仅有较弱的刺激T淋巴细胞增殖能力，且随着效应细胞数量的增加，刺激能力增强不显著，无直线相关关系(P＞0.05);而GM-CSF/IL-4组、GM-CSF/IL-4/SFI组诱导的细胞均具有刺激T淋巴细胞增殖能力，且随着效应细胞数量的增加，刺激能力增强，呈正相关(P＜0.01)。

表2 SFI对培养的K-562 DCs刺激T细胞增殖反应的影响(±s)

表2 SFI对培养的K-562 DCs刺激T细胞增殖反应的影响(±s)

注:与 K-562细胞组比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01;与 SFI组比较，▲P ＜0.01;与 GM-CSF/IL-4 组比较，#P ＜0.01;与组内 GM-CSF/IL-4/SFI(150 mg/ml)比较，★P ＜0.01;与组内 GM-CSF/IL-4/SFI(75 mg/ml)比较，■P ＜0.05，●P ＜0.01

比例1.067±0.015 1.080±0.026 1.090±0.026 75 mg/ml SFI组 1.127±0.021* 1.143±0.025* 1.157±0.015*GM-CSF/IL-4 组 1.330±0.026△▲ 2.067±0.035△▲ 3.050±0.036△▲GM-CSF/IL-4/SFI组9.38 mg/ml 1.340±0.036△▲●★ 2.080±0.026△▲●★ 3.080±0.036△▲●★37.50 mg/ml 1.663±0.032△▲#■★ 2.477±0.055△▲#■★ 3.440±0.040△▲#■★75.00 mg/ml 1.723±0.021△▲#★ 2.540±0.044△▲#★ 3.500±0.020△▲#★150.00 mg/ml 1.163±0.021△▲# 1.293±0.015△▲# 1.430±0.030△▲#1∶50 1∶10 1∶2 K-562细胞组组别

2.4 IL-12分泌水平 K-562 细胞组、75 mg/ml SFI组、GM-CSF/IL-4组 IL-12含量分别为(73.72±6.07)、(91.24±12.12)和(164.56±12.62)pg/ml，低、中(37.50 和 75.00 mg/ml)、高浓度(150 mg/ml)GM-CSF/IL-4/SFI组IL-12含量分别为(168.45±10.53)、(197.68± 11.98)、(218.36± 9.96)和(89.63±13.43)pg/ml。其中75 mg/ml SFI组IL-12含量低于 GM-CSF/IL-4组(P＜0.01)。GM-CSF/IL-4/SFI组中IL-12含量呈双向变化，高浓度组低于GM-CSF/IL-4组和中、低浓度GM-CSF/IL-4/SFI组(P＜0.01)。中浓度组IL-12含量升高，以75 mg/ml组升高最明显(P＜0.01)。低浓度组IL-12含量高于GM-CSF/IL-4组，但无统计学差异(P＞0.05)。

3 讨论

现代药理研究也证实，SFI及其组分——人参、附子均具有调节改善机体免疫的功能，可诱导造血基质细胞表达 GM-CSF mRNA，促进 TNF-α、IL-1、IL-2等细胞因子的产生，配合化疗可改善白血病患者正气不足之状［3～6］。

本实验发现，在GM-CSF/IL-4联合适当浓度(37.5、75 mg/ml)SFI的作用下，白血病细胞可以诱导分化为DCs，能明显增强白血病DCs表型(CD1a、CD80、CD83、HLA-DR)的表达率、提高其刺激 T 淋巴细胞的增殖能力及培养上清液中IL-12的含量。还发现在刺激T淋巴细胞的增殖能力中，T∶DCs的比例为2∶1、10∶1时，GM-CSF/IL-4组和中、低浓度GM-CSF/IL-4/SFI组诱导培养的白血病-DCs有强的刺激T淋巴细胞增殖的作用，尤其中浓度(37.5、75 mg/ml)GM-CSF/IL-4/SFI/组诱导培养的DCs刺激作用更强，且75 mg/ml SFI与GM-CSF/IL-4联合使用时具有很好的协同作用。当T∶DCs在50∶1时则刺激作用微弱，表明此时DCs的数量过少，分泌的IL-2太少，难以刺激过多的T细胞增殖。而高浓度/GM-CSF/IL-4/SFI(150 mg/ml)及单独应用75 mg/ml SFI诱导的细胞，在比例为 2∶1、10∶1、50∶1 时，刺激T细胞增殖的作用均较弱，可能与高浓度SFI抑制DCs的生成，以及SFI单独应用时作用微弱，无法诱导生成DCs，从而导致DCs数量过少有关。提示SFI对T细胞的增殖作用与其浓度及T/DCs的比例有关，适当浓度SFI可以使DCs产生IL-2以促进T细胞增殖，并进一步增强T细胞免疫应答［7］。

综上所述，SFI对K-562 DCs有促进成熟和抑制增殖的双向调节作用，中浓度(37.5、75 mg/ml)SFI联合GM-CSF/IL-4可进一步促进DCs的成熟，且75 mg/ml SFI与GM-CSF/IL-4有很好的协同作用。另一方面，高浓度的SFI(150、300 mg/ml)却抑制白血病DCs的生长甚至导致细胞死亡，其双向调节的作用机制有待于进一步的研究证实。

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