非诺贝特对糖尿病大鼠主动脉组织中Trx mRNA表达的影响

王 云，刘 谦，秦明照，任 洁，刘 琦

(首都医科大学附属北京同仁医院，北京100730)

高血糖引起的氧化应激不仅增加脂质过氧化，而且增强血管炎症反应，是加速糖尿病动脉粥样硬化的重要因素［1］。硫氧还蛋白(Trx)作为氧化应激的一个生物标志物，可以从一个方面反应机体氧化应激水平，同时Trx上调具有抗氧化的作用［2，3］。有研究表明过氧化物酶体增生物激活受体α(PPARα)激活可使Trx表达上调，而核内易位的Trx可抑制PPARα的活性［4］，在生理条件下二者形成一个负反馈环。高血糖刺激下应用PPARα激动剂对Trx的表达影响如何，相关报道较少。2009年10月～2010年6月，本研究通过检测Trx在糖尿病大鼠主动脉组织中的表达，应用PPARα激动剂非诺贝特进行药物干预，观察此药对Trx表达的影响，探讨糖尿病大鼠大动脉组织中氧化应激水平变化，药物对抗氧化应激的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择体质量180～200 g雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(级别SPF/VAF)，饲养于标准环境，12 h光照周期，自由进食水。普通饲料喂养适应环境1周后，随机分为对照组(C组，n=10)和实验组，对照组予普通饲料喂养，实验组给予高脂高糖饲料［5］(20% 糖 +2.5% 胆固醇 +10% 脂肪，67.5 %常规普通饲料)喂养4周后造模。

1.2 试剂 链脲佐菌素(STZ，美国Sigma-Aldrich公司);柠檬酸和柠檬酸钠(北京化学试剂厂)，10%水合氯醛(北京同仁医院制剂室)，非诺贝特胶囊(法国利博福尼制药公司惠赠)，TRIzol(美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒(美国Promega公司)，SYBR Green PCR Master Mix(英国ABI公司)。

1.3 糖尿病大鼠模型建立 禁食12 h后，实验组于腹腔注射STZ(45 mg/kg)行糖尿病大鼠造模。5 d后应用剪尾法取血测血糖，血糖值＞16.7 mmol/L即为造模成功［5］，纳入本实验，每周监测血糖、体质量。随机分为糖尿病组(A组，n=10)和药物干预组(B组，n=10)，A组给予蒸馏水灌胃，B组给予非诺贝特100 mg/(kg·d)，共灌胃8周。实验过程中A组死亡2只，B组死亡1只。

1.4 标本采集 全部大鼠采血前均禁食不禁水3 h，称重后应用10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，采用颈静脉插管取血约3 ml，置于不含抗凝剂真空采血管中，静置后离心(3 000 r/min)5 min，分离出血清。留取主动脉弓、胸主动脉组织标本于－80℃冻存。

1.5 大鼠生化指标测定 应用美国Beckman公司Unicel DxC 800型全自动生化分析仪测定血糖，血脂各项包括甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)。

1.6 大鼠主动脉Trx mRNA表达水平检测 每只大鼠分别取主动脉组织约100 mg(于－80℃冻存)，总RNA以TRIzol提取，逆转录为cDNA。应用实时定量PCR仪(英国ABI公司ABI7300)行实时定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)检测各组Trx mRNA水平。应用Primer express软件设计引物(美国Applied Biosystem公司)，引物由北京奥科生物技术有限公司合成，Trx上游引物F:5'-TCCAATGTGGTGTTCCTTGA-3';下游引物 R:5'-ATAGAACTGGAAGGTCGGCA-3'。18s上游引物F:5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3';下游引物 R:5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'。反应参数:50℃ 2 min，1个循环;95℃ 2 min，1个循环;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，50个循环;95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，95℃ 15 s，1个循环。18s rRNA作为cDNA定量的内参。以管家基因18 s为内参，计算出每个目的基因mRNA的相对含量，该值越高，表明目的基因在该模板的表达量越高。

1.7 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件，计量资料应用±s表示。各组资料首先进行正态性分布检验，非正态分布的计量资料分别取In对数转换。多组间变量比较采用单因素方差分析(ANOVA)，对ANOVA有统计学差异的变量进一步采用LSD进行两两组间比较。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量、血糖情况比较 见表1。

表1 各组大鼠体质量、血糖情况比较

2.2 各组大鼠血脂水平比较 单因素方差分析显示，血脂各项中各组TC、TG差异无统计学意义，P＞0.05。各组 LDL、HDL差异有统计学意义，P＜0.05。进一步行组间比较，结果见表2。

表2 各组小鼠血脂水平比较(mmol/L)

2.3 各组大鼠主动脉组织中Trx mRNA表达比较A、B、C组大鼠Trx mRNA表达水平分别为46.24、79.11、9.68，P ＜0.05。进一步行组间比较，A 组、B组Trx mRNA表达水平高于C组(P＜0.05)，B组高于A 组(P ＜0.05)。

3 讨论

贝特类药物是一类人工合成的PPARα的配体，也可以称为PPARα的药理性激动剂。临床上非诺贝特主要用于治疗混合性高脂血症和高三酰甘油血症。PPARα在肝脏和肾脏中表达量很高，同时在心肌和血管组织中也有表达。激活的PPARα可以介导载脂蛋白apoA-1表达，促进脂蛋白脂肪酶合成，并通过对一些目的基因表达的调控，使脂肪酸、TG和极低密度脂蛋白合成减少［6］。

本研究给予大鼠非诺贝特100 mg/(kg·d)干预，8周后检测血清TC、TG、HDL及LDL水平，结果显示TC、TG较对照组和糖尿病组无明显减低，但可明显降低LDL，同时升高HDL，这一结果与Ye等［7］的一致。本实验中未能看到其降低TC、TG的作用，考虑与高脂高糖饮食抑制大鼠食欲，减少其进食量有关，在造模前实验组动物体质量比对照组降低也证实此推论。但非诺贝特降低大鼠LDL，升高HDL的作用在本实验中是肯定的。

已有多个临床试验及动物实验证实贝特类药物在调脂同时还可以减低心血管事件的发生［8，9］，延缓动脉粥样硬化进程［10］。这些作用不仅与其降低血脂有关，而且与其参与目的基因表达的调控有关。研究证实，在Trx的远端启动子区有一段过氧化物酶激活物反应元件(PPRE)，激活的核受体PPARRXR异二聚体同这段序列发生特异性结合，进而激活Trx基因转录，激活 PPARα能上调 Trx的表达［4］。近期也有研究报道，在单核细胞衍生的巨噬细胞中PPARα特殊的启动子GW647可以上调Trx基因表达。上述研究均在细胞水平上进行，迄今在体动物实验关于PPARα对Trx表达调控的研究报道较少。本研究通过在体动物实验观察了非诺贝特对糖尿病大鼠主动脉组织中Trx mRNA表达的影响。结果显示，非诺贝特可以上调Trx mRNA表达水平，与对照组和糖尿病组比较，差异均有统计学意义。

到目前为止，已发现至少有60个转录因子的活性受到氧化还原环境的影响。Trx通过对蛋白氧化还原状态的调节，在体内调节多种转录因子的活性，如:抗氧化转录因子Nrf2、雌激素受体、糖皮质激素受体等转录活性。Trx对转录因子活性的调控决定了Trx对基因表达的影响。在细胞内过表达Trx能增强炎症介质诱导的血红素加氧酶的表达，从而起到细胞保护作用。另外应用重组Trx处理细胞也能调控某些基因的表达。Das等应用小剂量Trx即可显著诱导SOD的表达，Kontou等［11］发现还原型Trx能上调GAPDH和IKB的mRNA水平。可以推测Trx对转录因子及基因表达的调控在高糖氧化应激损伤及糖尿病大血管病变中可能具有非常重要的作用。本研究观察到非诺贝特可以上调大鼠主动脉组织中Trx mRNA表达水平，提示PPARα激动剂对心血管的保护效应是通过上调Trx的基因表达，从而影响Trx介导的一系列基因的转录活性，以发挥其抗氧化、抗炎、抑制炎症因子生成的作用［12］，这也可以解释非诺贝特具有调脂外的抗动脉粥样硬化的作用。

本研究非诺贝特可以上调主动脉组织中Trx mRNA表达，但我们没有观察非诺贝特对血清Trx的影响，而且不同剂量的非诺贝特或其他PPARα激动剂是否影响血清Trx水平有待在今后的工作中进一步研究。这些推论还需要进一步的研究加以证实和探讨。

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