ATRA对甲状腺鳞癌细胞株SW579细胞CDK4、CyclinD1、Rb 表达的影响

张秀梅，刘 超，闫纪亮，赵 颂，王翠瑶，肖建英

(辽宁医学院，辽宁 锦州 121001)

目前研究表明，CyclinD1、CDK4表达异常及Rb蛋白的磷酸化状态与多种恶性肿瘤的发生和发展有关［1］。我们以往的研究［2］表明，全反式维甲酸(ATRA)能够抑制SW579细胞生长，并将细胞阻滞于G1期;同时在mRNA水平上调P21及RARβ的表达。P21及RARβ是否通过调控细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK4、Rb的表达水平从而阻滞细胞周期还不明确。我们于2009年10月～2010年8月进行本实验，用ATRA处理甲状腺鳞癌细胞株SW579，应用RT-PCR及Western blot方法检测加入ATRA前后细胞周期因子CyclinD1、CDK4、pRb表达的变化，以期进一步了解ATRA抑制甲状腺鳞癌细胞增殖的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 ATRA、L15培养液、RT-PCR试剂盒(大连宝生物)、TRIzol试剂(Gibco BRL)、兔抗人CyclinD1、CDK4、Rb磷酸化多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶偶联的IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)，Sunrise自动酶标检测仪(瑞士TECAN公司)。

1.2 细胞培养与观察 甲状腺鳞癌细胞株SW579购自上海生命科学院细胞和生物化学研究所。培养于L15培养液中，饱和湿度、37℃、无CO2的条件下进行传代培养。当细胞处于对数生长期时以105个/ml浓度接种于25 cm2的培养瓶，24 h后待细胞贴壁后给药，使 ATRA 终浓度分别为 10－7、10－6、5×10－6、10－5mol/L，对照组加入 5 μl无水乙醇［乙醇浓度小于 0.1%(V/V)］。

1.3 半定量RT-PCR检测CDK4、CyclinD1、Rb基因mRNA的表达 采用TRIzol一步法提取细胞总RNA。使用AMV逆转录酶合成cDNA第1链，在Taq酶的作用下进行PCR的扩增。CDK4的循环条件:94 ℃ 2 min、94 ℃变性30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min(30个循环)，72℃ 5 min;CyclinD1的循环条件:94 ℃ 2 min、94 ℃变性30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min(30个循环)，72℃ 5 min;Rb的循环条件:94℃2 min、94 ℃变性30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min(30 个循环)，72℃ 5 min;β-actin的循环条件:94℃ 2 min、94 ℃变性30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min(30 个循环)，72℃ 5 min。取PCR产物10 μl进行琼脂糖凝胶电泳并拍照，应用凝胶图像分析管理系统进行灰度测量，mRNA的表达水平以每一样品与其内参βactin灰度比值表示。PCR引物序列及扩增片段长度如下:CDK4上游引物5'-TGATGCGCCAGTTTCTAAGAGG-3'，下游引物:5'-GGTCGGCTTCAGAGTTTCCACA-3'，扩增片段长度308 bp。CyclinD1上游引物:5'-GAAAGTAGGGACCTCAGAGG-3'，下游引物:5'-CTGTCCTCCCTCACACGTCA-3'，扩增片段长度 577 bp。Rb 上游引物:5'-TACCTAGCTCAAGGGTTAAT-3'，下游引物:5'-TAGCCATATGCACATGAATG-3'，扩增片段长度 300 bp。β-actin上游引物:5'-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3'，下游引物:5'-CAGGAGGAGCAATGATCTT-3'，扩增片段长度 384 bp。β-actin上游引物:5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3'，下游引物:5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3'，扩增片段长度661 bp。

1.4 Western blot检测 CDK4、CyclinD1、pRb 蛋白的表达 用蛋白裂解液提取对数生长期细胞总蛋白，采用BCA蛋白测定试剂盒蛋白浓度。总蛋白－20℃或－80℃保存备用。电泳前加入SDS样品缓冲液，100℃煮沸5 min，离心后上样，10%SDS-PAGE电泳分离，然后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，之后用含5%BSA的TBS(pH 7.4)将滤膜于室温摇动温育2 h进行封闭，封闭后的滤膜再分别与CyclinD1、CDK4、pRb磷酸化抗体(稀释比为1∶200)4℃温育过夜。经TTBS洗涤后，辣根过氧化物酶偶联的IgG作为二抗(稀释比为1∶5000)室温温育2 h，洗膜后使用ECL发光法显色，内参采用β-actin。扫描X光片，计算机软件处理，进行密度分析，计算灰度值。

1.5 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件，各组数据以表示，多样本均数检验采用方差分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ATRA 对 SW579 细胞 CDK4、CyclinD1、Rb 基因mRNA表达的影响 与空白对照组比较，ATRA组在一定浓度(10－7～10－5mol/L)范围内随着药物浓度的增加，CyclinD1 mRNA表达水平逐渐下降，且呈剂量依赖性(P ＜0.05)，但 CDK4、Rb mRNA 表达水平没有明显变化，见表1、图1～3。2.2 ATRA 对 SW579 细胞 CDK4、CyclinD1、pRb 蛋白表达的影响 与对照组比较，ATRA组在一定浓度(10－7～10－5mol/L)范围内，随着药物浓度的增加，CyclinD1蛋白表达水平、Rb蛋白的磷酸化水平逐渐下降，且呈剂量依赖性(P＜0.05)，但CDK4蛋白表达水平没有明显变化，见表2、图4。

表 1 CDK4、CyclinD1、Rb mRNA 的表达水平(，n=3)

表 1 CDK4、CyclinD1、Rb mRNA 的表达水平(，n=3)

组别 CDK4/β-actin CyclinD1/β-actin Rb/β-actin空白对照组0.381 ±0.021 0.574 ±0.072 0.202 ±0.022乙醇对照组 0.376 ±0.023 0.563 ±0.028 0.203 ±0.034 ATRA组(mol/L)10 －7 0.372 ±0.027 0.437 ±0.011 0.205 ±0.05410 －6 0.363 ±0.018 0.335 ±0.025 0.196 ±0.0395 ×10 －6 0.376 ±0.051 0.228 ±0.034 0.208 ±0.04210－50.385 ±0.046 0.115 ±0.015 0.211 ±0.023

表 2 CDK4、CyclinD1、pRb 蛋白的表达水平(，n=3)

表 2 CDK4、CyclinD1、pRb 蛋白的表达水平(，n=3)

组别 CDK4/β-actin CyclinD1/β-actin pRb/β-actin空白对照组0.398 ±0.076 0.582 ±0.089 0.653 ±0.016 ATRA组(mol/L)10 －7 0.343 ±0.051 0.411 ±0.023 0.492 ±0.06410 －6 0.331 ±0.075 0.336 ±0.045 0.396 ±0.0955 ×10 －6 0.343 ±0.026 0.248 ±0.018 0.287 ±0.03610－50.332 ±0.069 0.151 ±0.045 0.162 ±0.045

图4 Western blot检测细胞周期相关蛋白表达

3 讨论

本实验中，ATRA在mRNA和蛋白水平都下调了SW579细胞CyclinD1的表达，并呈剂量依赖性，该结果与文献报道［3～5］相一致。提示 ATRA抑制SW579细胞增殖与其下调CyclinD1的表达有关。

Rb是一个抑癌基因，非磷酸化(或低磷酸化)形式为活性型，能促进细胞分化，抑制细胞增殖。Rb蛋白的磷酸化程度与细胞周期密切相关，Rb蛋白通过结合或释放转录因子E2F来控制检测点进而控制细胞周期。E2F是一类激活转录作用的活性蛋白，控制着S期的重要蛋白质(包括DNA合成酶)的合成。低磷酸化的Rb蛋白与E2F结合，使E2F处于非活化状态，从而抑制相关蛋白质的合成，抑制细胞分裂;高磷酸化的Rb蛋白释放E2F，促使细胞进入细胞周期。有研究表明，ATRA能够降低胃癌细胞株 BGC-823、SGC-7901、MKN-45 Rb蛋白的磷酸化水平［6］，在MEPM细胞中，ATRA能够下调Rb蛋白的磷酸化水平，并降低CyclinD1、E蛋白的表达［7］。本研究证实，ATRA在一定浓度范围内下调甲状腺鳞癌SW579细胞Rb蛋白的磷酸化水平，与文献报道相一致。提示ATRA抑制SW579细胞增殖与下调Rb蛋白的磷酸化水平有关。Yu等［8］研究证实ATRA抑制MEPM细胞增殖，下调 CyclinD1、Rb蛋白的磷酸化水平，依赖于P21的表达，并需要维甲酸受体的参与，支持我们的结果［2］。

综合以往研究，我们认为ATRA抑制SW579细胞增殖的机制可能是通过高表达的RARβ与P21启动子上的维甲酸反应元件结合，促进P21的表达。P21下调了CyclinD1的表达，抑制CDK4的活性，从而使Rb蛋白的磷酸化水平降低，低磷酸化的Rb蛋白与E2F结合，使E2F处于非活化状态，从而抑制相关蛋白质的合成，抑制细胞分裂，将细胞阻滞于G1期，从而抑制SW579细胞的增殖。这种抑制机制是否也存在于其他甲状腺癌细胞中，本研究室还在进一步研究中。

［1］付锦艳，潘晓琳，杨安强.细胞周期调控相关蛋白 Cyclin D1、CDK4和pRb在新疆维吾尔族妇女宫颈癌中的表达及意义［J］.肿瘤防治研究，2009，36(11):969-972.

［2］肖建英，李男，张秀梅，等.ATRA对甲状腺鳞癌细胞生长及RARβ 和p21mRNA 表达的影响［J］.肿瘤防治研究，2010，37(7):759-762.

［3］Chang Q，Chen Z，You J，et al.All-trans-retinoic acid induces cell growth arrest in a human medulloblastoma cell line［J］.J Neurooncol，2007，84(3):263-267.

［4］Jia X，Liu B，Shi X，et al.Inhibition of benzo(a)pyrene-induced cell cycle progression by all-trans retinoic acid partly through cyclin D1/E2F-1 pathway in human embryo lung fibroblasts［J］.Cell Biol Int，2006，30(2):183-189.

［5］Huang M，Liu W，Li C，et al.The effect of sodium butyrate in combination with ATRA on the proliferation/differentiation of SKM-1 ［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2004，24(4):334-337.

［6］Wu Q，Chen Z，Su W.Growth inhibition of gastric cancer cells by all-trans retinoic acid through arresting cell cycle progression ［J］.Chin Med J(Engl)，2001，114(9):958-961.

［7］Yu ZL，Lin JX，Xiao Y，et al.Retinoic acid induced cell cycle arrest and apoptosis in mouse embryonic palatal mesenchymal cells［J］.Wei Sheng Yan Jiu，2005，34(5):566-569.

［8］Yu Z，Li W，Lu Q，et al.p21 is required for atRA-mediated growth inhibition of MEPM cells，which involves RAR ［J］.J Cell Biochem，2008，104(6):2185-2192.