Cbl-b shRNA稳定转染乳腺癌MDA-MB-231细胞系的构建

张凌云，石 晶，滕月娥，张 晔，曲秀娟，刘云鹏

(中国医科大学附属第一医院，沈阳 110001)

Cbl是在哺乳类动物体内广泛分布的细胞内蛋白，有C-Cbl、Cbl-b和 Cbl-c 3种。Cbl家族分子中含有多个不同的结构域，可以介导不同的细胞内分子结合，在细胞活化过程中可作为接头分子或支架分子参与信号转导;同时该分子中的RING finger结构域能够与泛素结合酶 E2结合，作为泛素连接酶E3促进其结合的靶分子发生泛素—蛋白酶体降解，因此参与细胞内信号转导的负调控机制［1，2］。近年来许多研究表明，Cbl家族RING finger结构域突变与肿瘤的发生及发展相关［3～6］，但 Cbl家族分子对肿瘤细胞生长、迁移及多药耐药等方面的调控作用及分子机制尚不清楚。2010年6月～2011年4月我们进行本研究，拟构建靶向Cbl-b基因的短发夹环RNA(shRNA)真核质粒表达载体，建立 Cbl-b shRNA稳定转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞系，为探讨Cbl-b的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞 人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长于含10%胎牛血清、12 U/ml庆大霉素的L-15培养基(Gibco)中。于37℃、饱和湿度的培养箱内培养。大肠杆菌菌株DH5α由本实验室保存。

1.2 试剂与抗体 转染试剂LipofectamineTM2000购于 Invitrogen公司;dNTP、dATP、pyrobest高保真聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、DL2000 DNA Marker购自Takara公司;质粒提取和DNA回收试剂盒由Qiagen公司提供;抗Cbl-b抗体、抗Actin抗体及HRP标记的羊抗鼠、兔二抗均购于Santa Cruz Biotechnology公司。测序服务由Takara公司提供。

1.3 方法

1.3.1 引物设计与合成 根据Cbl-b基因序列，通过软件设计两个靶序列，利用BLAST进行同源性分析，设计出1组Cbl-b shRNA序列及1组对照靶序列。引物序列Cbl-b(852 bp):5'-GATCCCGTTTCCGGTTAAGTTGCACTCGTTCAAGAGACGAGTGCAACTTAACCGGAAATTTTTTCCAAA-3'及5'-AGCTTTTGGAAAAAATTTCCGGTTAAGTTGCACTCGTCTCTTGAACGAGTGCAACTTAACCGGAAAGG-3'，引物序列空白对照:5'-GATCCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTGATATCCGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTCCAAA-3'及5'-AGCTTTTGGAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCGGATATCZAACGTGACACGTTCGGAGAACGG-3'。shRNA排列顺序均为:BamHⅠ酶切位点+反义序列+loop+正义序列+TC+HindⅢ和BamHⅠ酶切位点+正义序列+loop+反义序列+AG+HindⅢ。

1.3.2 构建靶向Cbl-b基因的shRNA真核质粒表达载体 选用pRNA-U6.1/Neo作为载体。化学合成法合成shRNA序列，将配对的单链合成双链，采用Bam-HⅠ/HindⅢ限制性内切酶进行酶切后，以T4连接酶连接于同样经过采用Bam-HⅠ/HindⅢ限制性内切酶进行酶切后的pRNA-U6.1/Neo载体内。将构建成的表达质粒转化至感受态菌DH5α中，将菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB平板，筛选阳性菌落。对构建完毕的质粒进行DNA测序，测序确认后进行大量复制、扩增并提取重组质粒。

1.3.3 基因转染 用含10%胎牛血清的L-15培养基培养MDA-MB-231乳腺癌细胞。将对数生长期的细胞于转染前24 h，按5×105/孔的密度接种于6孔培养板，当细胞达85% ～95%时按Lipofectamine 2000说明书进行脂质法转染空质粒和重组表达质粒。转染后48 h换为含G418(2 mg/ml)、10%胎牛血清的L-15培养液，每2～3 d换液。有限稀释法筛选2周后抗性克隆集落长出，挑取单克隆集落进行扩大培养。

1.3.4 Western Blot检测转染后细胞中Cbl-b的表达 收集转染后细胞进行裂解，提取细胞蛋白，取40 μg处理后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并电转移至PVDF膜，5%脱脂奶封闭1 h，一抗孵育1 h，TBST洗膜后二抗孵育30 min，TBST洗膜后加入ECL发光液，孵育5 min，暗室中用X片曝光、显影、定影。以未转染细胞系和转染对照质粒的细胞系作为对照，选取表达率为对照组10%以下的细胞株为阳性细胞株。

2 结果

2.1 靶向Cbl-b基因shRNA真核质粒表达载体的鉴定 将DNA测序结果和GenBank公布的人Cbl-b序列比对，结果显示Cbl-b shRNA和空白对照模板成功构建于 pRNA-U6.1/Neo载体上，序列完全正确，与目的序列相同。

2.2 空白对照组和Cbl-b基因沉默乳腺癌MDAMB-231细胞系筛选 Western blot结果表明在27株阳性克隆MDA-MB-231/Cbl-b shRNA细胞中，7、9、18号克隆细胞株Cbl-b表达水平明显低于空载体对照组，且18号克隆表达最低。Cbl-b基因沉默细胞系建系成功。见图1。

图1 Western blot检测Cbl-b表达

3 讨论

泛素—蛋白酶体途径介导的蛋白降解是机体调节细胞内蛋白水平与功能的一个重要机制。最近研究发现，泛素—蛋白酶体途径与肿瘤相关性脱调控有关，参与肿瘤转化、肿瘤进展、免疫监控逃逸及抗药性等真核细胞的许多代谢过程［4，5］。在此过程中需要3种酶的参与，即泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3。Cbl家族是泛素—蛋白酶体通路中的一种泛素连接酶E3，成员包括C-Cbl、Cbl-b和Cbl-c，可通过特异性选择底物蛋白，启动泛素化降解途径而参与细胞内信号转导的负向调控。其中C-Cbl与Cbl-b结构上具有79%的同源性，功能相似。C-Cbl及Cbl分子中含有多个不同的结构域，可以介导细胞内不同的分子结合，靶向降解以EGFR为代表的一系列具有酪氨酸激酶活性的受体蛋白，在维持机体稳态中发挥重要作用。目前 Cbl-b 已知的靶蛋白有 c-kit、EGFR、c-met、syk、Lyn、Grb2、P85 等［1，6］。但关于 Cbl-b 在肿瘤增殖、转移、耐药等方面的研究很少，因此需要进一步深入研究Cbl-b对肿瘤细胞信号转导的调控机制。

目前RNA干扰(RNAi)技术已经发展为高效、特异阻断细胞内目的基因表达的有效工具。与其他制备siRNA的方法，如体外转录法、化学合成法等比较，真核干扰表达载体既经济高效又可以进行长期稳定的研究。本研究用脂质体法将构建的Cbl-b基因干扰质粒转染MDA-MB-231乳腺癌细胞，通过G418筛选，获得稳定表达干扰质粒的细胞株。该细胞系的建立为首次报道，这为我们进一步研究Cbl-b对乳腺肿瘤细胞生长、迁移等的影响，探讨肿瘤治疗的新思路奠定了基础。

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