红藻氨酸致癫痫大鼠血清和脑脊液中S100B、CRP的动态变化

俸军林，鲁建华，蒋静子，唐永刚，林小慧

(1桂林医学院附属医院，广西 桂林 541001;2咸阳市中心医院)

胶质细胞损伤和炎症反应与癫痫的关系日益受到重视。目前关于S100B、C反应蛋白(CRP)与癫痫发作的研究不多。S100B蛋白被认为是脑内特异蛋白，是反映脑细胞损伤的早期指标［1］。CRP是一种敏感的急性时相蛋白，可以快速反映炎症变化，被誉为炎症标志物。2009年8～12月，我们采用立体定向技术行红藻氨酸(KA)侧脑室注射建立大鼠癫痫动物模型，通过检测大鼠癫痫发作后不同时间点血清和脑脊液中S100B、CRP水平动态变化并观察其相互关系，以探讨S100B、CRP与癫痫及其所致脑损伤之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性健康清洁级SD大鼠48只，体质量250～300 g，广西医科大学动物实验中心提供。饲养条件:温暖(20℃)，避强光、避噪音，单笼，自由进食和饮水。按照完全随机数字表法将实验动物分成模型组(40只)和对照组(8只)，模型组再按照不同处死时间分为造模后6 h、12 h、24 h、72 h和1周共5组，每组8只。

1.2 癫痫动物模型制备 以3.6%水合氯醛360 mg/kg腹腔注射将大鼠麻醉后，将其头部固定在立体定向仪上，常规备皮、消毒，沿头部正中线切开头皮、暴露前囟。根据大鼠脑立体定向图谱定位侧脑室(前囟后0.8 mm，右侧旁开 1.5 mm)，钻直径为1.0 mm的一个圆孔，深度达硬脑膜表面，注意尽量不伤及脑组织。将预先装有KA的微量进样器沿钻孔进针，深度达4.7 mm时向侧脑室内缓慢注射1 μg/μl KA 溶液1 μl(10 min 内匀速注射完毕)，留针5 min后拔除穿刺针，用骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合头皮，放回笼中进行行为学观察。按照Racine分级［2］判断癫痫发作程度，Ⅲ级以上为成功动物模型。如果造模失败，则用相同数量动物补充造模。对照组用等体积生理盐水代替KA行侧脑室注射。

1.3 血清及脑脊液标本采集 模型组大鼠在KA侧脑室注射致痫后6 h、12 h、24 h、72 h和1周分别采集血液和脑脊液。对照组大鼠注射生理盐水24 h后采集血和脑脊液。脑脊液采用经枕大孔直接穿刺法采集:先将大鼠头部固定在脑立体定向仪上，暴露寰枕筋膜，用微量进样器自大鼠枕外嵴下0.3 cm处朝向小脑延髓池方向进针抽取脑脊液，进针深度不超过0.3 cm，用无菌管收集脑脊液。然后暴露心脏，每只大鼠采心脏血2.5 ml。所有标本在室温下以3000 r/min离心20 min，取上清液置-20℃冰箱内保存待测。

1.4 S100B、CRP含量检测 采用ELISA法检测血清及脑脊液中S100B、CRP含量，试剂盒购自美国R＆D公司。双抗体夹心法测定大鼠血清和脑脊液中S100B、CRP水平，按照试剂盒说明书的步骤进行规范操作。以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线并计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0软件包进行统计学分析，计量资料以表示，依据实验数据类型作方差分析和相关分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠行为学观察结果 模型组大鼠在KA侧脑室注射后20～30 min即表现凝视、点头和湿狗样抖动，持续约30 min，1～3 h后出现反复发作的咀嚼、面部抽搐、肢体阵挛、身体背曲、尾部翘起、阵发性旋转、站立跌倒、后退等癫痫发作症状。每次发作数秒至10余秒，反复间歇性发作数小时，8 h后逐渐恢复到正常状态，24 h～1周出现自发性发作，以Ⅱ～Ⅲ级发作为主。对照组大鼠无上述痫样发作。

2.2 癫痫发作后各时间点血清和脑脊液S100B及CRP的动态变化 见表1。

表1 癫痫大鼠血清和脑脊液S100B、CRP含量比较()

表1 癫痫大鼠血清和脑脊液S100B、CRP含量比较()

注:与对照组比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01

组别 n S100B(μg/L)血清 脑脊液CRP(mg/L)血清 脑脊液6 h组8 0.21 ±0.05 0.33 ±0.05 5.82 ±0.93 6.61 ±1.0112 h 组 8 0.27 ±0.02* 0.40 ±0.05△ 8.41 ±1.40△ 10.15 ±1.34△24 h 组 8 0.54 ±0.07△ 0.72 ±0.02△ 10.01 ±1.80△ 13.31 ±1.78△72 h 组 8 0.25 ±0.05 0.33 ±0.03 6.20 ±1.19* 6.95 ±0.36*1 周组 8 0.23 ±0.05 0.31 ±0.05 4.77 ±0.94 5.97 ±0.90对照组8 0.20 ±0.03 0.29 ±0.05 4.39 ±0.92 5.28 ±0.96

2.3 S100B与CRP的相关性分析 模型组大鼠血清中S100B 与CRP 呈正相关(r=0.788，P ＜0.01);脑脊液中CRP与S100B也呈正相关(r=0.873，P＜0.01)。

3 讨论

S100B是S100家族中在脑内最具有活性的成员，主要存在于神经胶质细胞，被认为是神经胶质细胞的标记蛋白。胶质细胞覆盖了毛细血管表面积的85%，是血脑屏障的重要组成部分，在调节内皮细胞稳定性和血脑屏障渗透性之间的平衡中发挥重要作用，并可调节神经元的活动［3］。正常大脑由于完整的血脑屏障结构使S100B蛋白只出现在脑脊液，血清中含量较低。当神经系统疾病影响到血脑屏障的结构与功能时，结构受损的神经胶质细胞可释放S100B蛋白进入脑脊液，进而通过血脑屏障进入血液循环［4］。其机制有:①脑损伤后，S100B进入细胞间质，再经过受损的血脑屏障进入血液循环;②S100B从细胞液中渗出进入脑脊液，再经受损的血脑屏障进入血液［5］。Marchi等［6］提出 S100B 蛋白可作为反映血脑屏障损伤的外周生化标志物的理论。但是，关于S100B与癫痫相关性的研究目前尚无定论［7］。本实验结果显示，血清和脑脊液中S100B水平在KA侧脑室注射致痫后早期即开始升高，24 h达高峰，以后逐渐减低，1周后逐渐降至正常水平。结合前述文献资料，说明癫痫发作后早期即存在血脑屏障破坏和星形胶质细胞受损，血清和脑脊液中S100B蛋白可作为反映癫痫所致脑损伤早期的生化指标。

CRP在炎性反应或组织损伤发生后6～8 h开始升高，24～48 h可达峰值，被誉为炎症标志物［8］。炎症与癫痫的关系近几年来受到较大关注，在各种不同形式及病因的癫痫中，炎症反应可能参与癫痫发生及其神经元死亡［9］，而胶质细胞的激活和细胞因子的上调导致海马病理改变，如神经元死亡及反应性胶质增生［10］。Peltola 等［11］在强直—阵挛性发作后的癫痫患者中检测到CRP浓度升高，李洪亮等研究显示，癫痫患者发作后血清CRP含量于发作后24 h内明显增高，之后随时间的推移逐渐下降。本实验结果显示，血清和脑脊液中CRP含量在KA致痫后6 h即开始升高，24 h达峰值，同时，大鼠血清、脑脊液中的CRP与S100B均呈正相关，进一步证明炎症反应可能参与了癫痫发生及其所致的脑损伤。正常情况下CRP仅微量存在于血清及脑脊液中，癫痫后血清和脑脊液中的CRP水平增高可能与胶质的活化以及血脑屏障的破坏有关，其机理可能是因为与炎症相关联的细胞因子多由胶质细胞分泌产生。正常情况下，脑组织不表达或低水平表达细胞因子，而KA致脑组织兴奋性毒性损伤后，活化的胶质细胞在产生和释放蛋白标志物的同时可分泌大量的细胞因子，并进一步通过受损的血脑屏障进入血液中，从而引起血清和脑脊液中的CRP水平增高。

综上所述，KA致痫大鼠血清、脑脊液中的S100B与CRP水平呈现显著的动态改变，提示致痫大鼠脑内存在动态的急性炎症反应，这种炎症反应可能参与癫痫发生及癫痫所致的脑损伤。有关炎症反应与癫痫的病理机制，以及血清和脑脊液中S100B、CRP的临床应用价值尚有待进一步研究。

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