根茎类中药材有机氯及菊酯类农药多残留分析

黄晓会， 薛 健， 吴晓波， 佟鹤芳， 薛 雯， 庞作正

(1.中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京100193;2.宁夏医科大学研究生学院，宁夏银川750004)

中药材作为中国传统中医药学的一部分，在治病救人方面发挥着重要作用，特别是近年来，人们越来越倾向于回归自然，选择毒副作用较小的中成药作为治疗各种疾病的首要手段，同时随着中国医疗水平的提高，人们在医药方面的需求不断增加，中药材资源供应愈显不足，所以现在的大部分中药材都依赖于人工栽培。为了提高产量，防治病虫害，种植者频繁的使用各种农药，由于他们缺乏对农药本身的性质、农药对中草药的作用机制、农药残留特性和规律以及农药对环境的影响等方面的认识，往往造成中草药中农药残留污染。根茎类药用植物多为多年生草本植物，如丹参、地黄、板蓝根、黄芪等药材，由于生长时间长，更容易使农药蓄积，致使农药残留超标。农药残留超标不仅危害到人类的身体健康，还关系到我国名贵药材的出口创汇。20世纪80年代末云南省出口日本的三七被大量退货，目前我国在海外市场又日益受韩国高丽参的排挤，中药材进口国的技术壁垒，限制了我国中药材出口［1］，这在某种程度上影响了我国这一天然药物大国的形象。

有机氯及拟除虫菊酯类农药均是广谱杀虫剂，广泛用于杀灭农业害虫，曾是各国杀虫剂使用最广泛的农药。有机氯农药因其化学性质稳定，脂溶性大，残留期长，残留量高，易在脂肪中蓄积，拟除虫菊酯类使用后的毒副作用越来越明显，均可造成慢性中毒，严重危及人体健康［1］。世界各国已在20世纪70年代末禁止使用，但是目前仍然在土壤［2］，农产品［3］，中药材［4-5］中检测出来，而药材的种植期长，尤其是多年生的根类药材，易受其农药的污染［6］。目前中药中有机氯农药残留量的检测方法已经收入2010年版中国药典附录，但仅限于检测甘草、黄芪等几种中药中的六六六四个异构体、滴滴涕四个异构体和五氯硝基苯共9种有机氯农药［7］，这与我国500种常用药材的数量相比还有较大距离，也不能满足国内外对农药残留检测愈加严格的要求。因此，针对各种中药样品国内应该尽快进行更多种类的有机氯农药多残留分析方法学的摸索研究，以尽快建立一套适合于多种类中药的比较通用的有机氯和菊酯类农药多残留分析方法，以提高中草药在国际市场上的竞争力。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent-7890气相色谱仪;Agilent电子捕获检测器(ECD);Agilent-G4513A自动进样器;Agilent-DB1701(30 m ×0.32 mm ×0.25 μm)与 Agilent-HP-5(30 m ×0.32 mm ×0.25 μm)毛细管色谱柱;JSP-750A高速万能粉碎机(浙江省永康市金穗机械制造厂);PL203/01电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司);T-150超声波清洗器(北京天鹏有限公司);LABORATA-4000旋转蒸发仪(Heidolph);SHB-B型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)等。

1.2 药品与试剂 甘草、浙贝母、白芨、牛膝、天麻(购于安国药市)。正己烷(色谱纯 Fisher公司)，乙酸乙酯、无水硫酸钠、正己烷(分析纯北京化工厂)，乙腈(分析纯，北京化工厂)，Florisil硅土柱(1000 mg/6 mL，美国Agilent公司)，农药标准品(德国Dr.Ehrenstorfer公司，美国 Chem Service公司，德国Riedel-deHaen公司，美国Accustandard公司，农业部环境保护科研监测所)，纯度均在99.0%以上，详细信息见表1。

表1 农药标准品信息Tab.1 Standard of pesticides

2 实验方法

2.1 提取条件的选择 通过参考相关有机氯和菊酯类农药残留测定的方法，农药残留常用的提取方式有振荡法，索氏提取法，微波辅助提取法等［3］。考虑到实验室可行条件及此方法适合推广的要求，本实验采取了有机溶剂超声，然后过滤的提取方式。

通过对文献［8-10］的调查及农药的溶解性等各方面的因素，初步选择乙腈、正己烷、正己烷-丙酮(4∶1)、正己烷-乙酸乙酯(4∶1)四种溶剂作为本次提取条件选择的溶剂种类。考虑到提取时间以及提取溶剂量对提取结果的影响，因此对提取溶剂、提取时间、提取溶剂的体积三种因素进行优化选择。优化实验方案见表2。

表2 50种农药多残留气相测定提取方法优化实验方案表Tab.2 Orthogonal program of extraction

精确称取2.0 g甘草药材共5份(其中3份平行，同时做空白和基质添加标准工作溶液各1份)，加入500 μL质量浓度为400 μg/L农药标准品溶液，混匀过夜。按照正交试验设计冰浴超声提取后，再按照2.2项确定的净化条件净化，按2.3项测定样品，根据所得峰面积计算各实验的回收率，比较得出甘草药材经30 mL乙腈超声提取25 min后，提取的杂质较少，提取的农药的平均回收率在85.3%，各农药的回收率基本都在这一水平左右，除了pp'-DDD为71.5%、氟胺氰菊酯为73.6%以外，其他都在77.8% ～115.3%之间，而其他的提取系统都有较多不符合农残测定回收率在75%～125%之间的要求。

提取条件:精密称取2.0 g样品，置于100 mL锥形瓶中，加入2.0 g无水硫酸钠混匀加入乙腈溶剂30 mL，混匀。冰浴超声提取25 min，过滤。剩余的滤渣入滤纸中，用10 mL乙腈分多次冲洗锥形瓶再淋洗滤渣，合并滤液，于40℃水浴下旋转蒸发至近干，加入1 mL正己烷溶解，

2.2 净化条件的选择 分析试样中农药品种的不同以及采用不同的检测器，对净化的要求也有所不同。当分析有机氯农药时，通常采用电子捕获检测器，由于该检测器中放射源易受污染，所以对净化要求严格。

根据文献［11-13］有机氯和菊酯类农药多残留测定样品处理的净化柱种类一般为Florisil SPE柱、石墨化碳/氨基 SPE柱、C18SPE柱、中草药专用柱(TPH)。一般选用的正己烷-丙酮(9∶10)、正己烷-乙酸乙酯(95∶5)、正己烷-乙酸乙酯(85∶15)、而对于C18SPE柱对农药残留的洗脱一般用乙腈溶剂，石墨化碳/氨基SPE柱选用乙腈-甲苯(3∶1)。优化实验方案见表3。

表3 50种农药多残留气相测定净化方法优化实验方案表Tab.3 Orthogonal program of purification

精确称量2.0 g甘草药材共5份(其中3份平行，同时做空白和基质添加标准工作溶液各1份)，加入500 μL质量浓度为400 μg/L农药标准品溶液，混匀过夜。按照2.1项的提取方法处理后，浓缩样品加入用洗脱剂预淋洗后的SPE柱上，样品瓶用洗脱剂少量多次清洗后上柱，接取所有洗脱液后，在40℃下水浴旋转浓缩至近干，加入1 mL正己烷，按2.3项下的色谱条件测定样品，根据所得峰面积计算各实验的回收率，TPH正己烷-丙酮(9∶1)、Carb-NH2乙腈-甲苯(3∶1)、C18乙腈的总体平均回收率在75.4% ～82.4%之间，且各有较多的回收率不符合要求，用Florisil净化的总体平均回收率在91.7%～97.9%，符合农残测定的要求。Florisil SPE柱3个淋洗剂的净化效果基本相似，没有非常大的区别，相对而言从整个基线，以及5～20 min这一区间，以正己烷-乙酸乙酯(85∶15)＞正己烷-乙酸乙酯(95∶5)＞正己烷-丙酮(9∶1)。因此本实验采用Florisil SPE柱为净化柱，正己烷-乙酸乙酯(85∶15)为洗脱剂的净化系统。

净化条件:将Florisil柱置于固定架上，加1 cm左右高度的无水硫酸钠，用10 mL正己烷-乙酸乙酯(85∶15)的淋洗液进行淋洗，在淋洗液近干时快速移入样品浓缩液，用50 mL的茄型瓶接收淋出液，用2 mL的淋洗液多次充分的洗脱茄型瓶并转入柱中，收集洗脱液20 mL，于40℃水浴旋转浓缩至近干。加入1 mL正己烷溶解，作为样品溶液备用。

2.3 色谱条件的选择 参考国际通用的方法，采用2根不同极性的毛细管柱，如果2根不同极性的毛细管柱上同时可检测出某种农药，则可判定该样品中含有此有机氯农药，选用属于低极性的HP-5柱和属于中等极性的DB1701柱，经进样口、检测器、柱箱温度以及载气流量等试验，建立的色谱条件可以使50种有机氯农药得到较好的分离。图1为50种有机氯及菊酯类农药在HP-5柱上的出峰顺序，图2为其在DB1701柱上的出峰顺序，可以看出在改变柱子的极性后，农药的出峰时间和出峰顺序也发生改变，这样通过双柱比对做到互相补充可以帮助排除可能出现假阳性问题。

图1 50种有机氯和拟除虫菊酯类农药用HP-5柱的色谱图Fig.1 Chromatogram of 50 organchlorine and pyrethroid pesticides by HP-5 capillary column

图2 50种有机氯和拟除虫菊酯类农药用DB1701柱的色谱图Fig.2 Chromatogram of 50 organchlorine and pyrethroid pesticides by DB1701 capillary column

色谱条件:弹性石英毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)HP-5 与 DB1701 双柱定性，进样口温度250℃，不分流进样;升温程序为初始温度120℃保持1 min，以8℃/min的速度升温至150℃保持2 min，以4℃/min的速度升温至270℃保持14 min，再以10℃/min的升温速度升温至290℃，保持10 min;检测器温度300℃;体积流量1 mL/min;进样量 1 μL。

3 方法学评价

3.1 标准曲线 用标准贮备液分别配制出10、40、80、200、400 μg/L 的标准溶液，按 2.3 项色谱条件进行GC-ECD测定。以峰面积进行回归计算，得相应农药的回归方程，农药在10～400 μg/L范围内呈良好的线性关系，r2均大于0.9910。

3.2 仪器的精密度与灵敏度 取100 μg/kg混合标准品溶液重复进样6次，测得各农药的RSD值在0.6% ～4.9%之间，说明仪器精密度良好。根据各农药的信噪比，计算各农药的检出线(LOD)2.51～6.86 μg/L。

3.3 加样回收率与检测限 按所确定方法对5种药材分别做回收率实验。具体做法:取供试品，粉碎，过药典2号筛，取约2.0 g，一式9份，分别加入一定量的混合标准品溶液，使已知含有量的样品中农药质量浓度增加20，80，160 μg/L，每个质量浓度的样品3份，按以上优化后的实验方法处理并测定，计算相应回收率及RSD值。同时以最低质量浓度加样中噪音的3倍计算每种农药的检出限，以10倍噪音计算定量限。50种农药的回收率分别为69.1% ～ 108.3%(甘草样品)、65.5% ～ 110.4%(浙贝母样品)、69.8% ～ 107.9%(白芨样品)、65.6% ～ 111.3%(牛膝样品)、63.9% ～ 113.0%(天麻样品)，相对标准偏差均小于18%，检测限大多低于10 μg/kg，定量限大多低于 35 μg/kg(以牛膝样品为例)符合农药残留痕量测定要求。

3.4 重复性 精密称定样品(防己样品)9份，按2项优化后的实验条件制备的样品并进行测定，计算各农药的RSD均在2.51% ～8.15%之间，方法的重复性良好。

4 实际的样品测定

称取以上5种药材各6个批次，按照2项制备样品并进气相测定，外标法定量，1号甘草检出六氯苯 0.002 μg/g，西玛津 0.012 μg/g，氯硝铵 0.002 μg/g;2号甘草检出四氯硝基苯0.078 μg/g，六氯苯0.012 μg/g，溴氰菊酯 0.034 μg/g;3 号浙贝母检出六氯苯 0.001 μg/g，五氯硝基苯 0.002 μg/g，pp'-DDE 0.005 μg/g;4 号浙贝母六氯苯 0.002 μg/g，五氯硝基苯 0.011 μg/g;6号浙贝母检出 β-BHC 0.011 μg/g，六氯苯 0.015 μg/g;1 号白芨检出 δ-BHC 0.002 μg/g;4 号牛膝检出四氯硝基苯 0.046 μg/g;3号天麻检出西玛津0.002 μg/g和5号天麻检出西玛津 0.01 μg/g，β-BHC 0.011 μg/g。

5 讨论

本实验所建立的农药检测方法是根据中药本身的特点建立起来的一套系统的针对不同类中药材的有害残留物检测方法，在应用中，各级监测机构可以根据需要选择使用，能够满足科学研究、监管监测、外贸出口检测等多种需求。多种有害残留物限量标准的制定也将有利于提高我国中药行业整体的监管水平，提高我国中药产品的质量，解决一直没有标准和方法的尴尬状况，有力应对国际贸易中对我国中药产品设置的“绿色壁垒”。

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