刀豆蛋白A对帕金森患者外周血单个核细胞分泌IL－10和IFN－γ的作用

曹 丹 李晓红 任 艳，＊

曹 丹1，2，李晓红1，任 艳1

1中国医科大学附属第一医院神经内科，沈阳110001； 2沈阳市第四人民医院，沈阳110031

帕金森病（Par kinson Disease，PD）是以黑质纹状体多巴胺能神经元变性坏死为病理特征的神经系统疾病。近年来研究发现，免疫异常可能与PD的发病机制有关，特别是细胞因子作为免疫炎性反应产物参与该疾病的发生和发展日益受到国内外学者的关注［1］。干扰素－γ（IFN－γ）和白介素－10（IL－10）分别是具有代表性的 Th1型和 Th2型细胞因子，近年来研究发现两者的比例失调对自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病有着重要作用［2，3］。刀豆蛋白 A （Con A）是一种植物血凝素，能在体外激活非特异性T细胞丝裂原，对调节机体免疫反应具有重要作用。已有作者使用Con A来活化PD患者外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），在一定程度上调节了机体的免疫反应［4］，进一步证实免疫机制参与了PD的发病。目前国内外对PD患者外周血中细胞因子作用的研究报道不一致。因此，本文收集PD患者PBMC进行体外Con A刺激培养，分析其上清液中IL－10和IFN－γ的浓度变化，借以探讨 Th1／Th2细胞因子在PD发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 对象与分组

23例PD患者均为本院神经内科门诊和住院患者，并符合文献诊断标准［5］。采用改良Hoenh and Yahr Scale分级量表（HYS）将患者病情分为I～Ⅴ期，并据此分为两组，即早中期组（I～Ⅲ期）和晚期组（Ⅳ～Ⅴ期）。早中期组患者12例（男6例，女6例），病程4个月～5年；晚期组患者11例（男6例，女5例），病程5年～10年。健康对照组20例（男10例，女10例），年龄55～75岁，均来自本院健康体检中心。三组间年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 主要试剂和仪器

Con A购自美国Sig ma公司。精确称取Con A粉剂 用 RPMI－1640 液 配 制 成 10μg／ml溶 液，0.22μM滤膜过滤灭菌，4℃保存备用。人IFN－γ和IL－10检测试剂盒购自武汉博士德公司；酶标仪为瑞士SUNRISE RC。

1.3 外周血PBMC提取

参照有关文献［6］，于清晨6∶00～8∶00空腹状态下采取各组受试者肘静脉血5 ml，以密度梯度离心法提取PBMC。即在所取静脉血中加入Hank’s缓冲液和淋巴细胞分离液（比重1.077），收集血浆与淋巴细胞分离液交界处PBMC，将其悬浮于含0.05%（g／ml）小牛血清的RPMI－1640中，用台盼蓝染色计数活细胞数＞95%，用含小牛血清的RPMI－1640溶液均匀稀释至2.5×106／ml后，加入24孔板中。以普通培养基（RPMI－1640）和Con A（终浓度10μg／ml［7］）培养基（RPMI－1640＋ Con A）分别对各组PBMC进行培养，即置于37℃、5%CO2孵箱内孵育48h。离心取上清液，于－80℃冰箱内冻存。

1.4 IL－10和IFN－γ检测

于37℃水浴箱内解冻各组上清液，采用ELISA分别测定各组两种培养上清液中IL－10及IFN－γ水平。检测过程严格遵照试剂盒说明书进行操作。酶标仪检测吸光度（OD）后，计算IFN－γ或IL－10浓度。

1.5 统计学处理

所有数据采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。同组样本的不同培养方法之间作配对t检验，分组样本同一培养方法之间行组间t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 体外培养PBMC分泌IL－10浓度检测结果

对照组和早中期组PD 患者PBMC在Con A培养条件下分泌IL－10水平高于普通培养，差异有统计学意义（P＜0.05）；晚期组普通培养的PBMC分泌IL－10水平最低，受Con A刺激培养亦无显著增加（P＞0.05）。与对照组相比，早中期组PBMC在两种培养条件下分泌IL－10水平均有升高，但无统计学差异（P＞0.05）。而晚期组与早中期组相比均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1和图1。

表1 各组PBMC普通培养和Con A培养条件下分泌IL－10和IFN－γ水平比较（±s，pg／ml）

表1 各组PBMC普通培养和Con A培养条件下分泌IL－10和IFN－γ水平比较（±s，pg／ml）

注：与组内普通培养比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与对照组同种培养比较，3）P＜0.05，4）P＜0.01；与早中期组同种培养比较，5）P＜0.05，6）P＜0.01

细胞因子 对照组（n＝20）普通培养 Con A培养早中期组（n＝12）普通培养 Con A培养晚期组（n＝11）普通培养 Con A培养IL－10 5.82±3.74 7.87±3.211） 7.14±2.63 10.02±4.071） 3.81±1.046） 5.25±2.596）IFN－γ 202.32±30.68 323.63±37.77 1） 282.32±41.86 3） 721.43±65.73 2）4） 221.72±36.24 5） 414.63±40.69 1）6）

图1 各组培养PBMC分泌IL－10水平比较

图2 各组培养PBMC分泌IFN－γ水平比较

2.2 体外培养PBMC分泌IFN－γ浓度检测结果

各组PD患者PBMC分泌IFN－γ水平Con A培养比普通培养升高（P＜0.05，P＜0.01）。早中期组Con A培养的IFN－γ浓度最高，显著高于晚期组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），晚期组与对照组相比无显著差异（P＞0.05）。见表1和图2。

3 讨 论

越来越多的证据表明，PD发病与细胞免疫异常有关。Bogdan等［8］对PD患者外周血淋巴细胞进行了研究，发现其IL、TNF－α和INF－γ分泌比正常健康人显著提高，Bongioanni等［9］研究证实PD患者外周血淋巴细胞上细胞因子的受体表达异常，还有一些关于外周血淋巴细胞亚群的研究也提示PD患者外周血中存在T细胞异常激活［10］以及淋巴细胞亚群比例失调的现象［3，11］。活化T细胞分泌的Th1／Th2两种类型的细胞因子中，Th1主要包括IL－2、IFN－γ、IL－12等，而 Th2包括IL－4、IL－10等。Con A是一种植物凝集素，可直接诱导静息T细胞活化、增生、分化，继而激活细胞因子引发炎症反应，调控机体免疫反应。

本研究选取23例PD患者，根据其病情进行分期，检测其PBMC在Con A诱导培养时的IL－10和IFN－γ分泌水平。结果发现与对照组相比，早中期患者普通培养PBMC分泌IL－10有所增加，IFN－γ增加较多（P＜0.05），Con A刺激培养后的IFN－γ增加最明显（P＜0.01）。提示早期PD患者外周免疫系统已存在异常现象，表现为外周免疫细胞分泌抗炎因子基础水平上升，受Con A刺激后进一步升高，而抑炎因子基础水平也有所升高，刺激后升高明显，从而发挥一定的炎症调控作用，表明早期PD外周免疫系统存在异常激活和炎症，此时免疫细胞具备一定调节能力。因此推测外周免疫系统的过度激活参与了PD的早期发病过程，如果能在此时加强免疫调控，有可能对PD病情进展实现有效干预。而PD晚期免疫系统功能进一步紊乱，体外培养PBMC分泌IL－10水平低于健康对照组（P＜0.05），Con A刺激后亦无显著变化，表现为抑炎因子下降，并对刺激反应不灵敏，提示免疫系统调控能力进一步下降，抑炎系统分泌抑炎因子拮抗炎症的能力丧失殆尽。而IFN－γ在PD晚期基础水平表达与对照组相近，当PBMC受到Con A刺激后，分泌IFN－γ显著增加。提示PDⅣ～Ⅴ期患者的PBMC激活进入衰退期，对有丝分裂原的刺激只存在有限的反应能力。但由于基础水平下降，外周免疫细胞参与、启动免疫反应的能力与早期相比明显下降。PD晚期外周免疫功能全面下降和失衡，对脑内神经变性进展的参与能力也同样下降，脑内神经变性继续加重。

总之，PD的发病机制复杂，T细胞介导的自身免疫系统的紊乱在PD发生发展中起着重要的作用。以往研究证实，多种细胞因子参与PD的进程，Mizuta等［12］研究发现早期IFN－γ浓度增加可能有助于延缓疾病的进程。因此，对PD进行早期免疫反应干预可能对病程进展起延缓作用。

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